Cancer Cell | 肿瘤帮凶改邪归正！具核梭杆菌携手ICB合力抗癌

免疫检查点阻断疗法（Immune checkpoint blockade，ICB）已成为当前最有希望的癌症治疗策略之一。然而微卫星稳定（Microsatellite stability，MSS）结直肠癌（Colorectal cancer，CRC)对ICB响应性差，因此迫切需要寻找提高疗效的新途径。

2024年8月，香港中文大学于君教授团队Cancer Cell上发表了题为“Fusobacterium nucleatum facilitates anti-PD-1 therapy in microsatellite stable colorectal cancer”的文章。作者首先发现具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum，Fn）丰度与anti-PD-1对MSS CRC的治疗效果相关，后续研究表明Fn其代谢产物丁酸，可以极大增加anti-PD-1治疗MSS CRC疗效。

微卫星（Microsatellite）是单核苷酸、二核苷酸或高阶核苷酸重复（单位长度从10到60个碱基不等）组成的短串联（通常为1-6次）序列，散布在整个人类基因组中，这些位点容易受DNA聚合酶影响而出现DNA复制错误。微卫星不稳定性（Microsatellite instability，MSI）是指DNA错配修复缺陷导致的微卫星频繁多态性和单核苷酸置换现象。由于存在高突变负荷和新抗原，对免疫检查点抑制剂响应良好。而MSS型结直肠癌突变负荷较低，免疫原性较弱，故对免疫治疗的响应较差，其潜在机制仍不清楚。

肠道菌群在不同类型癌症的ICB治疗应答中有着至关重要的影响，虽然有研究利用肠道菌群成功逆转了黑素瘤的ICB治疗耐药性。但人们对驱动ICB反应的肠道微生物仍知之甚少。其中Fn被认为是CRC的致病病原体，其丰度与肿瘤进展呈正相关。但Fn能否调节MSS CRC对ICB治疗响应有待深入探索。

作者通过研究患有MSS CRC并接受抗PD-1治疗患者的粪便和肿瘤样本，发现Fn丰度与抗PD-1治疗的MSS CRC患者的生存期呈正相关。此外与Fn耗尽患者相比，Fn富集的CRC肝转移患者对抗PD-1治疗应答更高。总的来说，这些发现表明Fn可能改善MSS CRC患者的抗PD-1疗效，此结果在无菌小鼠建立原位CT26同种异体移植模型中得到验证。

为了模拟人体免疫应答，研究人员建立了原位HT29异种移植的CD34⁺人源化小鼠模型。Fn加速原位HT29肿瘤的生长，单独的抗PD-1未能抑制肿瘤生长。但是Fn增强了抗PD-1药物疗效，这些数据表明，在MSS CRC的人源化模型中，Fn减缓CD8⁺ TIL耗竭，并与抗PD-1组合再活化细胞毒性CD8⁺ TIL以介导肿瘤细胞杀伤。上述观察结果在无特定病原体野生型小鼠原位CT26及MC38基因模型得到验证，同时补充实验新增的变形杆菌（UA159）不能改善抗PD-1功效。

研究人员发现在无菌、CD34⁺人源化皮下植入HT29异种移植小鼠模型中，Fn灌胃促进肿瘤生长，但Fn和抗PD-1联用抗肿瘤作用增强。此外，Fn灌胃破坏了肠道屏障功能，这可能有助于Fn分泌物的全身分布。这些结果表明Fn通过诱导CD8⁺ TIL的系统活化来增强抗肿瘤免疫。

为了评估Fn分泌分子是否参与了增强抗PD-1疗效，研究人员发现Fn CM可促进小鼠MSS CRC中的抗PD-1疗效。

根据分子大小分级分离Fn CM，<3 kDa级分泌物在抑制CD8⁺ T细胞中的PD-1水平和增强细胞毒性功能方面效果最好，代谢物富集分析发现丁酸是在体外和体内的Fn最为富集的代谢物，且其以剂量依赖性方式降低CD8⁺ T细胞PD-1表达。除CD8⁺ T细胞外丁酸还对CD4⁺ T细胞有同样作用。这些结果证实，Fn在体外、小鼠和MSS CRC患者中均可降低CD8⁺和CD4⁺ T细胞的PD-1表达。

研究人员设计了不能合成丁酸的Fn突变菌株。与WT Fn CM或丁酸相比，Fn突变体CM在减少PD-1+CD8⁺ T细胞方面的有效性显著降低，将来自CT26荷瘤小鼠的CD8⁺ TIL，在Fn CM或Fn突变体CM中进行培养，结果验证了WT Fn CM增强抗PD-1作用，促进了细胞毒性标志物上调，而Fn突变体CM则无效。以上数据证实，Fn通过产生丁酸来增强CD8⁺ T细胞抗肿瘤作用。

研究人员使用来自患者外周血单个核细胞衍生的CD8⁺ T细胞与原代CRC类器官共培养，考察抗PD-1疗效。结果显示，与Fn突变CM+抗PD-1相比，Fn CM+抗PD-1或丁酸+抗PD-1处理显著增加CRC类器官中的细胞凋亡。通过IHC和FISH分析未接受抗PD-1治疗的MSS CRC患者的肿瘤切片，研究人员发现Fn和PD-1水平呈负相关。因此，Fn及其代谢物丁酸增强了人MSS CRC中的抗PD-1应答。

为了验证丁酸是否是增强抗PD-1疗效的关键Fn代谢物，研究人员在CT26同种异体移植模型中考察丁酸对CD8⁺ TIL的影响。结果显示丁酸加抗PD-1的抑瘤效果最好，经抗CD8α处理抑瘤作用消失。因此，Fn-丁酸轴可以抑制CD8⁺ TIL耗竭并重新激活其细胞毒性功能，以CD8⁺ T细胞依赖性方式促进MSS CRC中的抗PD-1免疫治疗。

为了探究Fn抑制PD-1表达的机制，RNA测序分析发现Fn CM显著改变CD8⁺ T细胞的细胞因子相关基因表达。此外，Tbx21作为活化T细胞中表达的关键转录因子，被Fn CM特异性上调。研究人员在CD8⁺ T细胞中进行了Tbx21敲除，发现PD-1蛋白表达增加，CD8⁺ T细胞活化受阻，表明Tbx21是由Fn-丁酸轴激活的中心节点，以增强CD8⁺ TIL抗肿瘤应答。

FITC标记的示踪剂追踪丁酸显示其在CD8⁺ T细胞的细胞核中积累，使用泛HDAC抑制剂处理CD8⁺ T细胞，均可抑制PD-1表达。相反，HDAC3/8抑制剂减少PD-1⁺CD8⁺ T细胞数量，表明HDAC3/8参与调节PD-1表达。这些数据推断Fn或丁酸抑制CD8⁺ T细胞中的HDAC3/8以调节PD-1表达。综上所述，Fn及其代谢物丁酸抑制HDAC3/8促进Tbx21启动子处富集H3K27ac，提高TBX21表达，随后下调PD-1并减轻MSS CRC中的CD8⁺ T细胞耗竭。

最后，研究了携带皮下HT29肿瘤的CD34⁺人源化小鼠，肿瘤内注射Fn CM。Fn CM+抗PD-1和HDAC3&8i+抗PD-1逆转了CD8⁺ TIL耗竭并激活了其细胞毒性功能。因此，Fn衍生的丁酸可以增强Fn在MSS CRC中抗PD-1疗效。

Fn是一种可促进CRC进展、转移和耐药性的致病菌，但本文证明了Fn生物合成丁酸，通过TBX21转录因子的表观遗传激活抑制CD8⁺ TIL中的PD-1表达，从而与抗PD-1一起提高细胞毒性CD8⁺ TIL和肿瘤细胞杀伤。因此，Fn等致病菌可能在MSS结直肠癌的发生和免疫治疗中发挥不同的作用。总之，Fn通过丁酸-HDAC3/8-TBX21轴抑制CD8⁺ TIL中的PD-1过表达，从而导致抗肿瘤免疫的再激活，在增强MSS CRC中的抗PD-1功效中起着至关重要的作用。这说明Fn丰度可能是预测MSS CRC中抗PD-1治疗的潜在生物标志物，并表明提高结肠丁酸可能是改善MSS CRC患者对抗PD-1免疫治疗的临床反应的潜在策略。

同时本项研究有一定局限性，首先在小鼠肿瘤模型中进行了功能和机制研究。需要进行额外的研究，以证实Fn对MSS CRC患者抗PD-1疗效的影响。其次，CD34⁺人源化小鼠不能完全重建所有人免疫细胞谱系，这可能阻碍免疫应答的有效性。

撰稿 | 陶恩祥

校稿 | 黄   玲

编辑 | 陈蓦珊

参考文献

1.Wang X, Fang Y, Liang W, et al. Fusobacterium nucleatum facilitates anti-PD-1 therapy in microsatellite stable colorectal cancer. Cancer Cell. 2024;42(10):1729-1746.e8. doi:10.1016/j.ccell.2024.08.019

2.Wang H, Zhou Y, Zhang Y, et al. Subtyping of microsatellite stability colorectal cancer reveals guanylate binding protein 2 (GBP2) as a potential immunotherapeutic target. J Immunother Cancer. 2022;10(4):e004302. doi:10.1136/jitc-2021-004302

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4.Mlecnik, Bernhard et al. “Integrative Analyses of Colorectal Cancer Show Immunoscore Is a Stronger Predictor of Patient Survival Than Microsatellite Instability.” Immunity vol. 44,3 (2016): 698-711. doi:10.1016/j.immuni.2016.02.025