Cell Host & Microbe | 肠球菌衍生的酪胺“劫持”肠干细胞a2A肾上腺素能受体以加重IBD

IBD的反复炎性损伤及多层粘膜损伤，必须经历愈合过程以恢复正常屏障功能。而Lgr5⁺ ISC增殖和分化可以提供重建上皮屏障所需的细胞库并促进损伤后的上皮再生。在疾病状态下，ISC重建上皮屏障的功能障碍是IBD的发病机制之一。

有研究表明肠道微生物群及其衍生代谢物能够影响ISC稳态和肠粘膜完整性。同时在IBD患者中通常会观察到肠道微生物群和代谢物的组成和功能发生重大变化。但这些变化是否会影响ISC活性，导致上皮再生改变并参与IBD疾病进展尚未可知。

ADRA2A在Lgr5⁺ ISC中高度表达

通过分析来自Lgr5-GFP小鼠的流式分选的Lgr5-GFP^hi ISC和Lgr5-GFP^lo祖细胞的公共RNA-seq数据集，作者发现Adra2a在两种细胞类型均存在明显表达，小鼠和人肠类器官中Adra2a的表达也特别高。ADRA2A的免疫染色同样证明了上述观察结果。这些发现说明ADRA2A在肠Lgr5⁺ ISCs中特异性表达，可能会发挥一些ISC调节功能。

酪胺是ADRA2A的微生物配体

基于PRESTO-Tango GPCR测定，作者对潜在的ADRA2A配体进行筛选，发现酪胺可重复地激活ADRA2A-Tango活性。随后的生物发光共振能量转移2（BRET2）试验进一步证明酪胺激活ADRA2A下游信号传导。同时还观察到酪胺诱导ADRA2A激活后cAMP水平呈剂量依赖性降低。

对酪胺的分离定量显示，与健康对照组相比，克罗恩病（Crohn’s disease，CD）患者粪便中的酪胺水平显著升高。此外公开数据集同样显示CD患者活检样本的ISC中ADRA2A表达增加。以上现象表明，酪胺-ADRA2A轴在人CD患者中富集。

高剂量酪胺通过ADRA2A抑制类器官中Lgr5⁺ ISC增殖

作者进而探索富集的酪胺是否对ISCs发挥调节功能。研究发现酪胺以剂量依赖性方式抑制肠类器官形成，并且Lgr5-GFP⁺ ISC细胞的百分比明显降低。这说明酪胺具有抑制Lgr5⁺ ISCs的类器官形成能力。当在育亨宾（ADRA2A拮抗剂）存在或类器官中ADRA2A的遗传缺失（ADRA2A KO）情况下进行了类器官测定时，上述现象明显减弱。这些数据表明酪胺可以通过ADRA2A抑制ISCs增殖。

对经酪胺处理的次级类器官进行了RNA-seq转录组分析，发现与对照组相比，其包括增殖标志物Ki-67（Mki 67）、细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）和细胞分裂周期基因25（Cdc 25）等在内的大量细胞周期调节基因显著下调。但在ADRA2A KO样品中降低的程度明显减弱。总之，这些数据支持了酪胺通过ADRA2A抑制类器官中Lgr5⁺ ISC增殖的猜想。

肠球菌衍生酪胺通过ADRA2A抑制小鼠Lgr5⁺ ISC增殖

作者在给予Lgr5-GFP报告小鼠酪胺自由饮水四周后，对Ki-67和Lgr5-GFP进行免疫染色以评估ISCs的增殖状态。与对照组（水）相比，酪胺暴露的小鼠的隐窝Ki-67⁺细胞数量和Lgr5-GFP⁺细胞百分比显著下降，隐窝类器官形成能力减弱。

选择在肠上皮中具有Adra2a条件性敲除的小鼠品系进一步评估酪胺是否通过ADRA2A抑制小鼠中的ISC，可以观察到Adra2a KO小鼠中隐窝的Ki-67⁺细胞数量减少趋势被抑制。评估酪胺处理后分化谱系的比例表明酪胺对肠道无明显遗传毒性作用且不会导致ISC向不同谱系的不平衡分化。总之，以上结论说明酪胺可以通过ADRA2A抑制ISC体内增殖。

作者进一步收集了粪肠球菌V583菌株，并通过自杀载体成功敲除了tyrDC基因使其丧失了产生酪胺的能力，将WT和tyrDC KO粪肠球菌菌株接种到GF小鼠中，与WT株定殖小鼠相比，tyrDC KO菌株定殖小鼠的粪便酪胺水平显著降低，结肠组织中每个隐窝的Ki-67⁺细胞数量增加。以上结果说明粪肠球菌的确通过产生代谢酪胺的tyrDC抑制小鼠ISC增殖。

肠球菌衍生的酪胺通过ADRA2A加重DSS诱导的IBD

在酪胺抑制ISC增殖的情况下，作者试图探究其对IBD的影响。在分别给予Adra2a^△IEC小鼠和Adra2a^WT对照小鼠酪胺或水4周，然后诱导DSS IBD模型。结果发现与水相比，在Adra2a^WT小鼠中，给予酪胺导致IBD严重程度显著增加，且细胞死亡相关裂解胱天蛋白酶-3信号更强。而在Adra2a^△IEC小鼠中，上述现象明显减弱，说明酪胺通过ADRA2A加重DSS诱导的IBD。这些结果共同支持酪胺加重DSS诱导的IBD。

将WT和tyrDC敲除粪肠球菌菌株经口定殖到抗生素预处理的以上两种小鼠中。经DSS诱导后，与WT株定殖的小鼠相比，tyrDC敲除株定殖的小鼠表现出IBD表型减轻。当两种菌株在Adra2a^△IEC小鼠中定殖时，未观察到IBD严重程度的显著差异。以上结论说明粪肠球菌菌株通过编码酪胺ADRA2A轴的tyrDC加重DSS诱导的IBD。

肠球菌在不同地理位置的CD人群中均存在富集

在研究肠球菌和酪胺在小鼠IBD中的功能之外，作者还探索了肠球菌和酪胺在人类IBD中的临床相关性。利用针对人类微生物组计划（HMP）参考基因组对人类肠道细菌中的TyrDC同源物进行了蛋白质基本局部比对搜索工具（BLASTP）搜索，发现肠球菌属是人类肠道微生物组中酪胺的主要生产者。此外微生物组16S rRNA基因测序发现肠球菌的相对丰度在CD患者的粪便中显著升高，这与独立分析来自地理上不同IBD/CD群组的一些公开的宏基因组/16S rRNA数据集结果一致。总的来说，肠球菌、酪胺和IBD之间的正相关性与肠球菌衍生的酪胺在实验性IBD中促炎作用一致。

育亨宾阻断肠球菌-酪胺-ADRA2A轴可改善DSS诱导的IBD

作者从CD患者中分离了单个肠球菌CD30菌株，并证明其TyrDC与粪肠球菌V583的TyrDC高度同源。经过细胞及动物实验验证了与粪肠球菌V583菌株相似，CD30菌株也能够通过ADRA2A加重DSS诱导的IBD。最后作者选择ADRA2A的拮抗剂育亨宾探索阻断肠球菌-酪胺-ADRA2A轴是否可以恢复ISC驱动的上皮再生并改善实验性IBD。给予上述屎肠球菌CD30及粪肠球菌V583菌株分别定殖的IBD小鼠育亨宾治疗，并评估IBD的严重性。与非治疗对照相比，育亨宾治疗显著改善了两个菌株定殖组中DSS诱导的IBD的表型。总之，这些结果支持用育亨宾特异性阻断ISCs中的肠球菌-酪胺-ADRA2A轴改善肠球菌/酪胺富集小鼠中DSS诱导的IBD。

本文阐述了一种全新的微生物-宿主相互作用，揭示了微生物-代谢物-GPCR相互作用的生理重要性。IBD与肠道微生物群的组成和代谢变化（生态失调）有关，尽管肠球菌和IBD之间相关性的证据已经出现，明确的因果机制关系一直难以证明，需要更多的研究来确定肠球菌/酪胺在人类IBD发病机制中的因果作用。

本研究利用基因工程/CD分离的肠球菌菌株和细菌定殖动物模型，并描述了肠球菌衍生的酪胺在特定小鼠IBD模型中的致病作用，证明了用育亨宾特异性阻断ADRA2A可显著降低肠球菌/酪胺介导的对ISC的抑制，并减轻小鼠IBD，提供了一种恢复IBD中ISC驱动的上皮再生和屏障功能的靶向策略。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38788722/

撰稿 | 陶恩祥

编辑 | 陈蓦珊

参考文献

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