2023年9月，香港中文大学于君团队在Gut杂志发表题为“Lactobacillus gallinarum-derived metabolites boost anti-PD1 efficacy in colorectal cancer by inhibiting regulatory T cells through modulating IDO1/Kyn/AHR axis”的研究论文，该研究发现在两种具有不同微卫星不稳定性（MSI）状态（MC38为MSI-H，CT26为MSI-L）的肿瘤移植小鼠模型中，鸡乳杆菌可显著提高抗PD1的功效。它通过减少Foxp3+ CD25+调节性T细胞（Treg）瘤内浸润，增强CD8+ T细胞的效应功能，促进抗PD1响应。经鉴定，鸡乳杆菌衍生的吲哚-3-羧酸（ICA）为功能性代谢物。
机制上，ICA抑制吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO1）的表达，从而抑制肿瘤中犬尿氨酸（Kyn）的产生。此外，ICA还与Kyn竞争芳烃受体（AHR）结合位点，拮抗Kyn与CD4+ T细胞芳烃受体的结合，从而抑制Treg分化。ICA在体内复现鸡乳杆菌显著提高抗PD1的作用，而补充Kyn可以逆转这一作用。总之，该研究发现鸡乳杆菌衍生的ICA通过调节IDO1/Kyn/AHR轴抑制CD4+ Treg分化和增强CD8+ T细胞功能，提高CRC抗PD1的疗效。
01
研究背景
目前ICB疗法在CRC中的临床应用方面有限，仅被批准用于高度微卫星不稳定性（MSI-H）或错配修复缺陷（d-MMR）CRC患者。即使患者符合ICB治疗的条件，仍有大部分患者可能难以治疗，甚至对抗PD1治疗没有反应。因此，迫切需要确定新的佐剂来提高ICB疗法响应。目前肠道微生物群已成为决定各种癌症中ICB反应重要因素。先前研究证明，鸡乳杆菌（Lactobacillus gallinarum）是一种在CRC患者粪便中丰度显著降低的益生菌，通过分泌色氨酸代谢产物吲哚-3-乳酸（ILA）抑制结直肠肿瘤发生。色氨酸在肠道微生物群主要通过血清素、犬尿氨酸和吲哚衍生物三种代谢途径形成各种衍生物参与机体免疫调节。色氨酸代谢物是一类具有免疫调节作用的代谢产物，可诱导Th17极化，促进CD4 CD8双阳性上皮内淋巴细胞分化。因此，作者继续在本篇文章探讨L.gallinarum的免疫调节作用及其在抗PD1治疗CRC疗效中的具体机制。请随本文一起揭秘鸡乳杆菌作为一种潜在的佐剂所发挥的抗肿瘤免疫作用机制！
02
研究思路
01
L.gallinarum提高MC38和CT26同源肿瘤移植小鼠模型的抗PD1的疗效
为探究L.gallinarum能否提高PD1抗体响应，作者构建MC38同源肿瘤移植小鼠模型，给予抗PD1或IgG同型对照处理，与对照组相比，L.gallinarum组的抗PD1疗效提高，显著抑制肿瘤生长。作者进一步探究L.gallinarum是否促进CT26同源肿瘤移植小鼠抗PD1疗效，结果同前述一致。因此，L.gallinarum增强PD1抗体疗效。接着作者使用无菌小鼠模型证实L.gallinarum单独定植也可以增强抗PD1疗效。表明L.gallinarum单独定植可以调节抗肿瘤免疫作用，且该作用不取决于肠道微生物群组成。
综上，L.gallinarum可以增强CRC的抗PD1疗效。
02
L.gallinarum减少肿瘤微环境中Treg的浸润，增强CD8+ T细胞的效应功能
免疫治疗响应与肿瘤微环境免疫细胞浸润密切相关，作者进一步检测肿瘤微环境内免疫细胞的变化，发现L.gallinarum单菌或联合抗PD1治疗均能减少Foxp3+CD25+ Treg细胞浸润，同时促进肿瘤杀伤性T细胞浸润。同时，L.gallinarum单独处理不能抑制肿瘤生长，与BHI和E.coli组相比，L.gallinarum联合抗PD1组肿瘤中，IFNγ+ CD8+ T细胞显著增加。免疫组织化学（IHC）染色进一步证实L.gallinarum联合抗PD1治疗减少Foxp3+细胞浸润下降。
Treg通过表达CTLA4、分泌IL-10和TGF-β来抑制过度的免疫反应，而这种免疫抑制性可能在肿瘤微环境或其他情况下促进了肿瘤细胞的免疫逃逸。趋化因子导向Treg细胞向肿瘤微环境（TME）浸润，Treg激活后参与抑制抗肿瘤免疫反应。为进一步证实L.gallinarum免疫调节作用依赖于肿瘤微环境中Treg浸润减少，解除肿瘤微环境免疫抑制效应。作者用抗CD25单克隆抗体（CD25抗体特异性耗竭Treg，进而解除免疫抑制）处理建立Treg耗竭小鼠模型，发现给予抗CD25单克隆抗体后，补充鸡乳杆菌与正常给予PD-1抗体疗效一致，这表明鸡乳杆菌通过减少肿瘤微环境中Treg浸润从而发挥免疫调节作用。
综上，L.gallinarum通过减少Treg细胞的瘤内浸润，改善肿瘤微环境免疫抑制，增强CD8+ T细胞的效应功能从而增强抗肿瘤疗效。
03
L.gallinarum增强AOM/DSS诱导的CRC肿瘤模型的抗PD1疗效
为探究L.gallinarum作为抗PD1潜在佐剂，在改善CRC免疫治疗方面的转化潜力，作者通过AOM/DSS化学诱导小鼠CRC模型从而模拟人类CRC的发展，并在给予抗PD1治疗开始前1周补充L.gallinarum，结果发现L.gallinarum联合抗PD1组显著抑制肿瘤生长，同时Treg浸润降低、CD8+ T细胞效应功能增强。总的来说，L.gallinarum与PD1抗体在CRC治疗中起协同作用。
04
L.gallinarum在体外和体内产生色氨酸代谢物作为功能代谢物
目前研究认为L.gallinarum主要通过产生抗肿瘤代谢物从而抑制CRC发生。作者通过代谢组学分析确定调节抗肿瘤免疫代谢物。非靶向代谢组学分析显示L.gallinarum培养上清液中，多种色氨酸代谢物显著富集，包括吲哚-3-甲醛（IAld）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚乳酸（ILA）。体内代谢组学分析显示L.gallinarum组小鼠粪便IAld水平升高。为进一步探究IAld是否为调节抗肿瘤免疫的代谢物，作者构建了一种表达芳香族氨基酸氨基转移酶（ArAT，IAld合成的关键细菌酶）的E.coli突变株（E.coli-ArAT），并联合抗PD-1给予CT26细胞系构建CRC小鼠，结果发现E.coli-ArAT组的肿瘤生长受抑制，且抗PD1疗效显著提高。由上可知，细菌ArAT的表达/IAld的产生是调节抗肿瘤免疫和提高抗PD1疗效的关键参与者之一。
由于小鼠结肠癌细胞皮下移植瘤远离肠道的背侧，因此，作者推测L.gallinarum来源的代谢物首先在肠道中产生，然后进入血液并最终到达肿瘤组织。结果发现血清和肿瘤组织中的IAld水平没有明显差异，表明IAld不是调节抗肿瘤免疫的终代谢物。然而L.gallinarum处理组的小鼠血清和肿瘤中IAld下游代谢物3-吲哚甲酸（ICA）显著富集。
由此，作者推测L.gallinarum首先产生IAld，在血液中转化为ICA，而ICA可能是免疫调节的功能性代谢产物。
05
L.gallinarum和ICA可抑制肿瘤中IDO1的表达和Kyn的产生
代谢组学显示色氨酸类代谢物除ICA升高外，Kyn水平以及犬尿氨酸与色氨酸（Kyn/Trp）比率降低。其中Kyn主要促进Treg发育和免疫逃避，且主要由吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）通过色氨酸转化产生。由此，作者推测L.gallinarum抑制肿瘤中的IDO表达减少Kyn产生。
接下来作者对MC38同源肿瘤移植小鼠模型肿瘤组织进行RNA测序并通过基因富集分析发现L.gallinarum联合抗PD1组的色氨酸代谢途径显著下调，IHC染色显示CT26同源肿瘤移植小鼠模型肿瘤组织中IDO1表达降低，表明L.gallinarum抑制IDO1表达，减少肿瘤组织中Kyn的产生。鉴于ICA为L.gallinarum的功能代谢物，同时为确证ICA是否抑制IDO1的表达，作者通过体外IFNγ（诱导IDO1表达）和ICA共孵实验，发现ICA显著抑制IDO1的表达。同时，液相色谱-质谱（LC-MS）分析显示其代谢产物Kyn减少，进一步证实上述结果。
综上，L.gallinarum和ICA抑制IDO1表达并减少肿瘤中Kyn的产生。
06
ICA通过抑制AHR激活从而拮抗Kyn介导的Treg分化
为探索L.gallinarum产生的代谢物对Treg分化的影响。作者用L.gallinarum的上清液、IAld或ICA处理naïve CD4+ T细胞，结果均未对Treg分化产生明显影响，这提示ICA对Treg分化不存在直接影响，而是间接影响。目前已知ICA和其他色氨酸代谢物（包括Kyn）可激活AHR，而AHR激活与Treg分化和免疫逃逸有关。为探索ICA是否与Kyn（AHR激动剂）存在受体竞争，从而拮抗Kyn介导的AHR激活，作者用Kyn和ICA处理CD4+ T细胞，发现Kyn明显诱导Treg分化，且ICA拮抗Kyn介导的Treg分化。此外，作者检测CD4+ T细胞AHR靶基因CYP1B1（细胞色素P4501B1）的表达，发现ICA明显抑制Kyn诱导的CYP1B1表达，AHR拮抗剂CH-223191也抵消Kyn和ICA介导的Treg分化。因此，ICA可以拮抗Kyn诱导的AHR激活。
为探究ICA与AHR相互作用关系，作者通过分子对接分析发现ICA与AHR蛋白的配体结合域（LBD）结合，并与Kyn竞争相似结合位点，且ICA和AHR结合能与Kyn和AHR结合能接近，这表明ICA和Kyn之间对AHR的结合或构象稳定性相当。作者进一步使用表面等离子体共振（SPR）测定发现ICA和Kyn都可与AHR结合，而ICA对AHR受体的亲和力更高，这说明两种代谢物之间存在拮抗关系。为进一步探索动力学机制，作者用不同剂量的ICA和Kyn处理小鼠T细胞构建Lineweaver-Burk图，发现ICA作为一种竞争性AHR抑制剂至少部分抑制AHR激活。
综上，证实ICA直接与CD4+ T细胞AHR受体结合，从而拮抗Kyn介导的AHR激活和随后的Treg分化。
07
ICA提高抗PD1疗效，补充Kyn可逆转
为确认ICA抗肿瘤免疫中的调节作用，作者构建CT26同源肿瘤移植小鼠模型同时给予抗PD1和ICA，发现ICA显著减少肿瘤组织中Treg浸润并增加IFNγ+ CD8+ T细胞，补充Kyn则逆转ICA作用，进而提高抗PD1疗效从而抑制肿瘤生长。ICA治疗还降低血清和肿瘤组织中Kyn水平以及肿瘤中Kyn/Trp比值。IHC进一步证实IDO1表达降低。以上结果均与L.gallinarum处理同源肿瘤移植小鼠一致，这揭示L.gallinarum或ICA通过IDO1/Kyn轴调节抗肿瘤免疫。
因此，L.gallinarum通过其产生的ICA可通过双重机制改善抗PD1治疗：（1）抑制IDO1的表达和Kyn的产生；（2）通过受体竞争抑制Kyn与AHR的结合。
03
总结展望
作者分别在不同微卫星不稳定性状态的同源肿瘤移植小鼠模型（MC38，CT26）以及AOM/DSS诱导的CRC肿瘤模型中，证实L.gallinarum主要通过减少Foxp3+ CD25+ Treg细胞的瘤内浸润以及增强CD8+ T细胞的效应功能增强抗PD1的疗效。L.gallinarum及其产生的代谢物ICA通过调节IDO1/Kyn/AHR轴抑制调节性T细胞从而提高结直肠癌抗PD1疗效。值得注意的是，虽然体内外代谢组学分析观察到一致的药效学变化，包括灌胃ICA或L.gallinarum后Treg浸润减少、Kyn水平降低和IDO1表达受抑制，但不能排除动物表型变化可能是由其他分子机制造成的。此外，ICA和其他代谢物的吸收、分布、代谢和排泄特性等药代动力学方面需要进一步研究。总的来说，L.gallinarum在CRC中作为一种潜在的增强抗PD1疗效的佐剂，为临床中CRC的免疫治疗提供了新的思路。
原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10715476
撰稿 | 李 瑞
审稿 | 赖长杰
编辑 | 顾韫慧
参考文献
1. Sugimura N, Li Q, Chu ESH, et al. Lactobacillus gallinarum modulates the gut microbiota and produces anti-cancer metabolites to protect against colorectal tumourigenesis. Gut. Published online December 22, 2021. doi:10.1136/gutjnl-2020-323951
2. Fong W, Li Q, Ji F, Liang W, Lau HCH, Kang X, Liu W, To KK, Zuo Z, Li X, Zhang X, Sung JJ, Yu J. Lactobacillus gallinarum-derived metabolites boost anti-PD1 efficacy in colorectal cancer by inhibiting regulatory T cells through modulating IDO1/Kyn/AHR axis. Gut. 2023 Nov 24;72(12):2272-2285. doi: 10.1136/gutjnl-2023-329543
转载须知：
【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。
合作、投稿、转载、约稿事宜请联系
邮箱：immunometabolism@163.com
