科研技巧之特异性引物设计篇

文摘 2024-09-27 20:59 中国

引物设计原则：

长度：引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38bp
GC含量：引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近
碱基分布：碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。3'端最好不要是连续碱基，GGG 或CCC会导致错误的引发，同时 3'端最后一个碱基最好不要是A或T，会导致错配
Tm值：引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳
引物序列在模板内没有相似性较高的序列，否则容易导致错配（设计完成后可以使用BLAST检索，确认引物特异性）
引物二聚体及发夹结构的能值不能过高（能值的绝对值一般不要超过4.5），过高易导致产生引物二聚体带并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行
引物修饰：引物的延伸是从3'端开始的,不能进行任何修饰；引物的5'端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性

一、主流网站

Primer3

网址：http://primer3.sourceforge.net/webif.php

优点：操作简单，用户只需在网站输入DNA序列，即可快速生成引物设计结果。筛选功能强大，支持根据PCR产物大小、引物大小、Tm值等多种参数对结果进行筛选。多用途，不仅限于PCR引物设计，还可用于设计PCR-ELISA的杂交探针等。

缺点：定制化程度有限，虽然提供了多种筛选条件，但某些特殊需求可能无法完全满足。作为在线工具，需要稳定的网络环境才能使用。

NCBI Primer-BLAST

网址：通过NCBI官网（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）访问Primer-BLAST

优点：权威可靠，依托NCBI的丰富数据库，确保引物设计的准确性和特异性。功能全面，除了设计引物对，还能检测引物的特异性，减少非靶向扩增的风险。兼容性好，支持多种生物体的序列，适用于广泛的科研领域。

缺点：搜索结果可能较多：需要用户自行筛选最合适的引物对。操作相对复杂：相比一些简单的在线工具，其操作界面和流程可能略显繁琐。

使用方法：打开NCBI，选择Nucleotide，接着输入目的基因名点击search。

选择目的物种的对应基因，查看exon和CDS区，保证引物设计在CDS区中。

点击Pick Primers

在引物范围内输入一定区间，保证引物落在CDS区域内，调整模板长度及其它对应参数，选择合适的数据库后，点击Get Primers。

选择合适结果，并对引物反向blast检查其特异性。

PrimerBank

网址：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

优点：数据库丰富：提供了大量经过验证的引物序列，用户可直接挑选使用。便捷性高，用户只需输入目的基因的NCBI Gene Symbol，即可快速获取相关引物信息。被标为绿色的引物表示已经过文章验证，具有较高的可信度。

缺点：覆盖范围有限：可能无法覆盖所有研究所需的基因或物种。用户无法根据具体需求自定义引物设计参数。

Serial Cloner

网址：http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html

优点：功能全面：除了引物设计外，还支持虚拟PCR、限制性位点分析、酶切测试等多种功能。可用于制作克隆质粒图谱等实验材料。

缺点：下载安装：需要用户下载并安装软件到本地计算机上。相对于在线工具，其操作界面和功能可能较为复杂，需要一定的学习成本。

Integrated DNA Technologies (IDT)

网址：https://sg.idtdna.com/country.aspx

优点：专业性强：提供针对PCR反应的多种有用工具和服务。定制化服务：可根据用户需求设计特异性的寡核苷酸等。资源整合：除了引物设计外，还提供PCR反应优化、实时PCR实验等全方位支持。

缺点：商业化网站：部分功能或服务可能需要付费才能使用。操作界面可能较为复杂：对于非专业用户来说可能需要一定的适应时间。

二、其他网站

除了之前提到的Primer3、NCBI Primer-BLAST、PrimerBank、Serial Cloner和Integrated DNA Technologies（IDT）等在线引物设计网站外，还有其他一些值得关注的在线引物设计资源。以下是一些额外的在线引物设计网站及其简要介绍：

①qPrimerDepot：

这是一个提供经过验证的引物序列的数据库，用户可以直接搜索并挑选适合自己实验的引物。

优点：引物质量有保证，减少了自行设计引物可能带来的不确定性。

缺点：可能无法覆盖所有研究所需的基因或物种。

②RTPrimerDB：

专注于实时PCR（qPCR）引物和探针的数据库，提供了大量针对特定基因的qPCR引物信息。

优点：对于需要进行qPCR实验的研究者来说，这是一个非常有用的资源。

缺点：同样存在覆盖范围有限的问题，且用户可能无法完全自定义引物设计参数。

③OligoArchitect：

这是一个功能强大的在线引物设计软件，允许用户根据具体需求自定义引物设计参数，并生成高质量的引物序列。

优点：定制化程度高，能够满足不同实验的特殊需求。

缺点：可能需要一定的学习成本来熟悉其操作界面和功能。

④Gene Quantification Page：

虽然这个网站本身不直接提供引物设计服务，但它是一个关于qPCR实验知识的宝库，包括qPCR的应用方法、定量算法、循环参数等。

优点：对于qPCR实验的新手来说，这是一个很好的学习资源。

缺点：不直接提供引物设计功能。

⑤Saccharomyces Genome Database (SGD)：

专注于酵母基因组的数据库，提供了针对酵母基因的引物设计服务。

优点：对于研究酵母基因组的科研工作者来说，这是一个非常专业的资源。

缺点：仅适用于酵母基因组的引物设计，对于其他物种的引物设计则不适用。

⑥ResearchGate 和 Protocol Online：

这两个网站虽然不直接提供引物设计服务，但它们是科研工作者交流和分享实验经验的平台。用户可以在这些网站上找到与引物设计相关的讨论、经验和建议。

优点：提供了丰富的实验经验和建议，有助于用户更好地进行引物设计。

缺点：需要用户自行筛选和判断信息的准确性和适用性。

撰稿 | 陶恩祥

编辑 | 陈蓦珊

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