2023年9月，中山大学的高嵩团队、韩辉团队和北京大学的白凡团队在Science Immunology杂志上合作发表文章“Mitochondria-ER contact mediated by MFN2-SERCA2 interaction supports CD8+ T cell metabolic fitness and function in tumors”，阐述了线粒体融合蛋白-2（MFN2）介导线粒体-内质网（mito-ER）接触以维持线粒体Ca2+稳态，从而促进CD8+ TIL的代谢适应性和效应功能。因此，通过增加CD8+ T细胞中MFN2表达来增强mito-ER接触是改善癌症免疫疗效的有效措施。
肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的过继转移和免疫检查点阻断（ICB）在癌症免疫疗法中广泛应用，但如何持续、完全应答仍有待解决。肿瘤微环境（TME）中T细胞效应功能缺失是免疫疗法失败的主要原因之一。
线粒体融合蛋白（MFN）是负责线粒体融合且定位于线粒体外膜的动力蛋白GTP酶，有助于增强氧化磷酸化（OXPHOS）能力。MFN2可以介导mito-ER接触，具体机制还不清楚。作为线粒体行为的调控中心，MFN2的突变或异常表达会扰乱代谢，进而增加神经肌肉疾病、心脏代谢性疾病及癌症等风险。
01
肿瘤内活化CD8+ T细胞的MFN2上调，癌症患者生存期延长
作者分析了肾透明细胞癌（ccRCC）和黑色素瘤患者的肿瘤样本，发现MFN2表达高的患者生存期更长。对患者的CD8+ TIL进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），发现MFN2在活化的CD8+ T细胞上调，参与OXPHOS和免疫功能的基因表达增加。通过单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）发现激活蛋白-1（AP-1）通路是MFN2表达增加的上游调控机制。
02
MFN2促进体内CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫和效应功能
为了探究MFN2对T细胞功能的调节作用，作者构建了T细胞特异性敲除Mfn2小鼠（Mfn2CKO小鼠）模型，Mfn2敲除后肿瘤生长加快，IFN-γ表达减少，细胞增殖（Ki67）减慢，凋亡增加，对αPD-1治疗无响应，表明MFN2缺失损害了CD8+ T细胞的活化、增殖、存活和抗肿瘤功能。通过scRNA-seq和单细胞转录组学分析进一步证实。因此，MFN2对于TME内T细胞的活化、增殖、效应功能和存活具有重要意义。
03
MFN2缺失会损害由FAO供能的肿瘤内CD8+ T细胞线粒体呼吸能力
借助批量RNA-seq、GO富集分析和基因组变异分析（GSVA）等方法，作者发现Mfn2敲除导致与T细胞活化、代谢、线粒体膜组织和ER稳态相关的通路下调，同时脂肪酸（FA）代谢、OXPHOS和脂肪形成相关的代谢途径受损。MFN2缺乏导致线粒体OCR降低，FA摄取减少，损害了线粒体利用FA作为底物产生能量的能力。加入脂肪酸氧化（FAO）抑制剂依托莫西（Etx）可以消除WT型和Mfn2-/-的CD8+ T细胞在FA摄取和IFN-γ产生方面的差异。因此，MFN2可以促进肿瘤内CD8+ T细胞基于FAO的线粒体代谢。
04
MFN2介导的mito-ER接触有助于CD8+ T细胞的线粒体代谢和抗肿瘤作用
接下来，作者研究了Mfn2-/-的CD8+ T细胞中线粒体代谢受损的机制。研究表明，MFN2通过介导线粒体融合和/或mito-ER接触来调节线粒体代谢。由于MFN2缺失并没有使线粒体形态发生明显改变，故排除线粒体融合的影响。相反，Mfn2敲除细胞中的mito-ER接触减少，线粒体中Ca2+水平降低。用Ru360（线粒体Ca2+摄取抑制剂）处理可降低脂质代谢和IFN-γ产生。因此，MFN2介导的mito-ER接触和线粒体Ca2+内流可以促进CD8+ TIL的线粒体代谢和效应功能。
05
MFN2与ER上的SERCA2互作以介导mito-ER接触
为了确定MFN2如何介导mito-ER接触，作者借助质谱分析和Pull-down实验鉴定出MFN2在ER上的潜在互作蛋白SERCA2，并通过CO-IP、3D活细胞成像、邻位连接测定（PLA）和体外Pull-down实验证明二者的直接相互作用。通过构建MFN2突变质粒（T105M、T130A、R94Q和R259A），作者发现MFN2-SERCA2互作依赖于GTP酶活性和构象柔性。这些结果证明了MFN2和SERCA2在mito-ER接触位点处的相互作用。
06
MFN2-SERCA2互作有利于维持细胞内Ca2+稳态
由于SERCA2具有Ca2+泵的作用，作者研究了MFN2-SERCA2对Ca2+转运的作用。体内外酶活测定和Ca2+荧光探针Fluo-5F定量发现MFN2可以浓度依赖性地增加SERCA2活性，进而增加线粒体Ca2+内流。线粒体内Ca2+水平在SERCA2敲低时几乎不变，但是经SERCA2抑制剂毒胡萝卜素（Tg）处理后升高，由此推测SERCA2可能还参与在mito-ER接触位点将Ca2+泵送回ER的过程。通过过表达红色荧光接头蛋白增加mito-ER接触和荧光共振能量转移实验得到证实。综上所述，MFN2与SERCA2互作促进线粒体Ca2+内流，并协助SERCA2在mito-ER接触位点回收Ca2+，有利于维持线粒体Ca2+稳态和细胞存活。
07
MFN2-SERCA2介导的mito-ER接触和线粒体Ca2+内流促进肿瘤内CD8+ T细胞功能
作者将转染了WT或突变型Mfn2的Mfn2−/−OT-I CD8+ T细胞过继转移到携带B16-OVA的小鼠中，MFN2缺失导致抗肿瘤作用受损，IFN-γ产生减少，mito-ER接触减少，而过表达MFN2或线粒体钙单向转运体（MCU，促进线粒体Ca2+摄取）可以提高Ca2+水平，增强脂质代谢，促进TME中细胞存活。因此，MFN2-SERCA2互作对mito-ER接触和线粒体Ca2+内流具有调节作用，有助于促进TME中CD8+ T细胞的线粒体代谢和抗肿瘤作用。
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促进MFN2表达可以改善T细胞肿瘤免疫疗效
最后，作者研究了TME中MFN2对CD8+ T细胞功能的作用。ccRCC条件培养基处理会减少CD8+ T细胞的线粒体代谢、MFN2表达和mito-ER接触，但可以通过MFN2过表达恢复。用来氟米特（促进MFN2表达）治疗B16荷瘤小鼠得到类似的结果。此外，低剂量来氟米特与αPD-1联用进一步抑制肿瘤生长，延长小鼠存活期。由此可知，加强CD8+ T细胞中的MFN2表达可能是改善癌症免疫疗效的有效辅助策略。
本研究表明，在肿瘤浸润性CD8+ T细胞中，MFN2通过与ER上Ca2+-ATP酶SERCA2相互作用来增强mito-ER接触，促进线粒体代谢所需的Ca2+内流。MFN2协助SERCA2从ER中回收Ca2+，防止线粒体Ca2+过度积累导致的细胞凋亡。因此，通过增加CD8+ T细胞中的MFN2来提高mito-ER接触可以有效改善癌症免疫疗效。
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37738362/
撰稿 | 顾韫慧
审稿 | 李 瑞
编辑 | 陈蓦珊
参考文献：
1.Yang JF, Xing X, Luo L, et al. Mitochondria-ER contact mediated by MFN2-SERCA2 interaction supports CD8+ T cell metabolic fitness and function in tumors. Sci Immunol. 2023;8(87):eabq2424. doi:10.1126/sciimmunol.abq2424
2. Naón D, Hernández-Alvarez MI, Shinjo S, et al. Splice variants of mitofusin 2 shape the endoplasmic reticulum and tether it to mitochondria. Science. 2023;380(6651):eadh9351. doi:10.1126/science.adh9351
