摘要：2017年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了首批两种嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法。批准的适应症是用于治疗复发或难治性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），以及用于治疗25岁以下急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者，这些患者的病情难治或处于第二次或之后的复发。自那时以来，全球范围内一直在对不同的血液学和实体肿瘤进行CAR-T疗法的安全性和疗效评估。例如，高达60%的患者复发和某些副作用（如细胞因子释放综合征CRS）使得CAR-T疗法的局限性变得明显。这促使了广泛的临床活动，旨在克服这些障碍，以便扩大CAR-T疗法的使用。提高疗效和安全性的尝试包括改变CAR-T给药时间表，将其与化疗结合，以及开发下一代CAR-T疗法，例如，通过使用CAR-自然杀伤细胞（CAR-NK）和CAR-巨噬细胞（CAR-Ms）。本综述将关注血液系统恶性肿瘤中的新CAR-T治疗策略，旨在提高疗效和解决副作用的临床试验，CAR-T疗法在实体肿瘤中面临的挑战，以及旨在克服这些挑战的正在进行的研究。
1.引言
CAR-T细胞是经过基因改造的T细胞，它们在细胞表面表达合成受体，通过识别特定肿瘤抗原来检测和消灭癌细胞（图1）。与T细胞不同，CAR-T细胞能够在没有人类主要组织相容性复合体（MHC）分子的情况下识别癌细胞表面的抗原。因此，CAR-T细胞能够区分比天然T细胞更广泛的目标。当CAR-T细胞与目标抗原结合时，它们被激活并充当“活性药物”，攻击肿瘤。自2017年以来，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准六种CAR-T细胞疗法用于血液癌症。Kymriah（tisagenlecleucel）和Yescarta（axicabtagene ciloleucel）是首批被批准用于治疗25岁以下难治性/复发性B细胞前体急性淋巴细胞性白血病（ALL）患者和成人难治性/复发性弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的CAR-T产品，这些患者在经过两线或更多系统治疗后。此后，更多的CAR-T细胞治疗获得了批准。总共有六种CAR-T细胞产品中的四种是抗簇分化（CD）19 CARs，而两种最新的CAR-T细胞产品针对B细胞成熟抗原（BCMA）。表1显示了每种CAR-T细胞产品的批准适应症和详细信息。
CAR-T治疗在上述适应症中实现的高反应率对于没有其他替代治疗选择的难以治疗的患者群体具有临床意义。在过去的几年中，CAR-T细胞疗法在治疗这类血液恶性肿瘤方面取得了相当的成功。然而，疗效方面的一个显著关注点是实现缓解后的高复发率。同样，安全性问题也是患者和治疗医生的另一个问题，例如，细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性。除了CAR-T副作用对患者的严重性外，其管理还大大增加了CAR-T疗法的高成本。CAR-T治疗的主要毒性是细胞因子释放综合征（CRS），包括在CAR-T输注后出现的一系列可能危及生命甚至致命的反应。CAR-T治疗激活T细胞，导致高水平的细胞因子如IL-6、IL-10和干扰素（IFN）-γ的释放。CRS的主要细胞因子是IL-6，它是CRS的免疫反应如发热、寒战、头痛和不适的主要原因。同样，它也负责许多严重且潜在危及生命的症状，如血管渗漏综合征和播散性血管内凝血（DIC）。神经毒性是在接受CAR-T细胞治疗的患者中经常看到的另一个安全问题。尽管神经毒性的确切机制尚不明确，但已经提出了可能的病理生理原因：一个是中枢神经系统（CNS）中细胞因子水平的升高可能导致神经毒性；另一个是细胞因子水平的升高增加了血脑屏障（BBB）的通透性，允许CAR-T细胞穿透并引起神经毒性。
细胞因子释放综合征(CRS)的管理需要正确评估其严重程度，通常使用国家癌症研究所(NCI)开发的CRS严重程度量表。随后进行一般管理，包括立即给予tocilizumab，这是一种IL-6拮抗剂，可单独使用或与皮质类固醇一起使用。此外，应立即开始针对CRS影响的身体系统和器官的特定治疗。CRS可以影响不同的身体系统和器官，症状从轻微到严重，甚至使人虚弱。CRS的适当管理包括其他医学专业，如神经学、肾脏学和心脏病学，除了治疗血液学家外，所有人都在一起工作，以解决不同的身体系统/器官。严重CRS的治疗通常在重症监护室进行。CRS治疗的成功取决于在症状出现时立即实施必要的措施。在管理神经毒性方面，标准治疗是皮质类固醇，因为tocilizumab对BBB的穿透有限。
除了对疗效和安全性的担忧外，另一个问题是如何应对限制CAR-T细胞疗法应用的障碍。
大约90%的癌症是实体瘤，但目前CAR-T细胞疗法的适应症仅限于治疗血液恶性肿瘤。上述问题表明，这种疗法仍存在多种需要解决的障碍。本综述将展示CAR-T细胞疗法在癌症治疗中的挑战，并提出优化CAR细胞疗法的潜在策略。本文还将对未来疗法的发展进行推测。
2.CAR的代际
CAR-T疗法的积极结果促使持续的研究，试图在提高CAR-T活性的同时最小化毒性。目前，已经开发或正在开发中的CAR-T有四代。一般CAR的组成在图2中展示。第一代CAR设计简单，仅包含细胞内区域的激活域（CD3ζ链）。这种CD3ζ的简单结构具有有限的治疗活性。该结构可以发送信号，导致T细胞的激活；然而，它不支持细胞扩张，这是疾病控制的必要步骤。为了克服这个问题，第二代CAR-T增加了一个共刺激信号域（例如，CD28、4-1BB和OX40），添加到细胞内区域，从而实现双信号配置，导致显著的细胞扩张和改善的活性。第三代CAR（图2）是在第二代的基础上开发的。它在细胞内区域除了激活域CD3ζ链外，还有两个共刺激域，从而增强了CAR-T细胞的存活。随后，开发了第四代CAR-T细胞。它们被称为抗原非限制性细胞因子启动的T细胞重定向杀伤（TRUCKs）。它们通过引入额外的转基因来产生可诱导的细胞因子（例如，白细胞介素（IL）-12）。这不仅改善了细胞功能，还调节了肿瘤微环境（TME）。
图2. 通用CAR和第三代CAR的结构。左侧：CAR的主要结构由三部分组成：外域、跨膜域和内域。外域包含一个单链可变抗体域(scFv)以识别肿瘤抗原和一个提供结合灵活性的间隔区。跨膜区域连接外域和内域。内域负责传导信号，由一个或多个共刺激分子组成，如分化群(CD)28和4-1BB，以及一个刺激性分子，CD3ζ。右侧：第三代CAR的共刺激域包括两个共刺激分子，CD28和4-1BB。
3.疗效问题及克服策略
3.1. CAR-T细胞疗法复发的机制
接受CAR-T疗法后复发的患者主要分为两组：抗原阳性复发和抗原阴性复发。抗原阳性复发发生在对CAR-T疗法的反应不足时，对CAR-T细胞的影响最小，仅有短暂的B细胞再生障碍。通过流式细胞仪，可以在细胞表面检测到CD19。这种类型的复发与CAR-T细胞在人体内的持续存在和增殖不足有关。抗原阴性复发是由抗原逃逸引起的，可能是由基因突变引起的。例如，CD19阴性复发代表了高达20%的复发CAR-T细胞治疗患者。在CD19阴性复发中，细胞表面未检测到CD19。这是由于CD19基因的外显子1-13发生突变。外显子1-4携带细胞外结构域的代码，外显子5-13携带跨膜域的代码。可以通过流式细胞仪测量CD19阴性细胞的百分比，它还能评估等位基因突变的频率以及细胞中纯合子丧失和双等位基因突变的百分比，这些是CD19靶向表位丧失的主要原因，随后从抗CD19 CAR-T的效果中逃逸。
3.2. 克服CAR-T复发的策略
对CAR-T细胞的初始反应后的复发仍然是一个主要问题。已经开发了不同的策略来克服这个问题，例如开发新的CAR-T设计和与其他疗法的结合。这些策略中的一些在表2中总结。
3.3. 克服抗原阳性复发的策略
3.3.1. 与其他疗法的结合
为了克服这种类型的复发，正在进行的研究正在评估将CAR-T与其他疗法结合，例如开发人工抗原呈递细胞（AAPCs）和开发具有新设计的CAR。AAPCs是一种旨在开发一个平台的技术，其中APC提供控制信号以刺激T细胞扩张和T细胞上具有特定分子表型和活性的特定分子。AAPCs可以使用特定细胞系的信号转导或来自合成材料（如涂有特定细胞因子或其他刺激性分子的聚苯乙烯）来衍生。在疾病缓解后定期给予AAPCs以刺激CAR-T细胞是一种延长临床反应的新策略。目前正在临床研究中进行测试。此外，癌症免疫学研究表明，专业抗原呈递细胞在遇到肿瘤抗原时向T细胞发送的信号可以影响CAR-T细胞治疗的疗效。这导致了旨在开发人工抗原呈递细胞的活动，或者控制在遇到肿瘤抗原时向T细胞发送的信号。
3.3.2. 新的CAR设计
另一种尝试是防止抗原阳性细胞，即生成具有截断的IL-2受体β链域和转录因子的CAR-T细胞，例如3/5转录因子和信号转导因子。这些被认为是第五代CAR。这个概念目前处于探索阶段；然而，它在不同血液和实体癌的临床前模型中进行了测试，显示出与当前可用的CAR-T细胞相比，改善了细胞增殖和持久性。
3.4. 克服抗原阴性复发的策略
3.4.1. 与其他疗法的结合
预防抗原阴性复发的另一种方法是将双特异性T细胞引导分子（BiTEs）与CAR-T细胞疗法结合。BiTE的一侧设计用于结合CD3并激活T细胞，另一侧针对肿瘤抗原。与BiTEs的结合允许CAR-T细胞通过改变BiTEs来针对不同的抗原。这一概念已在临床前模型中进行了测试，以避免抗原逃逸。BiTEs和CAR-T的结合是一种双特异性抗体（BsAbs），它将T细胞招募到肿瘤细胞。两者都是有效的免疫疗法；它们使用抗体片段将T细胞重定向到肿瘤特异性抗原。它们在B细胞血液肿瘤中显示出相当的成功，目前正在测试用于实体瘤的治疗。临床前研究表明，CAR-T.BiTE，即CAR-T细胞与BiTEs的结合，可以消除小鼠模型中表达异质EGFRvIII的肿瘤。EGFRvIII是胶质母细胞瘤（GBM）的特定肿瘤抗原，而EGFR是在胶质母细胞瘤中经常过表达的抗原，但也在正常组织中表达。当GBM中EGFRvIII突变丢失时，野生型EGFR仍然保持。因此，T细胞上的CARs被设计为攻击表达EGFRvIII的肿瘤细胞。同时，CAR-T细胞分泌BiTEs以重定向CAR-T细胞，并招募旁观者T细胞对抗野生型EGFR。在用CART.BiTE治疗的研究中，已经观察到消除EGFRvIII阴性、EGFR阳性的胶质母细胞瘤。
3.4.2. 新的CAR设计
具有“OR”逻辑门的多抗原特异性CARs针对同一T细胞表面上的不同抗原。设计是在单个T细胞上呈现双特异性CARs以针对肿瘤上表达的两种不同抗原。它已在临床前研究中进行了测试，并显示出积极的结果。例如，多次试验报告了由于CD19阴性白血病细胞的出现而导致的患者复发。在临床前研究中，小鼠在接受CD19/CD20 OR-gate CAR-T细胞后，混合（75% CD19+/CD20+，25% CD19−）B细胞恶性肿瘤被完全清除，并且在109天内没有复发迹象。然而，单一输入CD19 CAR-T细胞只能消除纯野生型（CD19+/CD20+）肿瘤细胞，而不能消除混合B细胞肿瘤。“OR”逻辑门策略的替代方案是使用两种CAR-T细胞系的混合CAR-T细胞，这些细胞系针对一个以上的抗原。工程化的人T细胞被一个抗原的信号激活，而共刺激信号功能由特定于第二个抗原的共刺激分子承担。这一概念已在临床前证明，并目前正在临床研究阶段。通用CAR的开发使单一CAR-T细胞系能够通过给予不同的适配分子作为配体来结合多种抗原。这种方法旨在在不需要制造额外CAR-T细胞的情况下克服抗原逃逸问题。
4.CAR-T疗法副作用及克服策略
4.1. 靶向肿瘤活性：细胞因子相关毒性
细胞因子释放的程度反映了T细胞激活的程度，这对实现足够的临床效果至关重要。然而，它也是免疫相关不良事件（irAEs）的原因，包括CRS和神经毒性。因此，预防细胞因子相关毒性的策略是减少T细胞活性或阻断细胞因子效应。
最近，包括肿瘤学家、神经学家、心脏病学家和急诊医学专家在内的专家小组审查了CAR-T和由于CAR-T治疗而发展的irAEs的现有研究。讨论的成果作为美国临床肿瘤学会（ASCO）管理接受CAR-T治疗患者的irAEs的指南发表。该指南旨在支持治疗医师管理在接受CAR-T治疗期间发生的最常见irAEs，包括CRS、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）、感染、B细胞再生障碍和细胞减少症。CRS的管理已在上文提及。可能发生的其他严重irAEs是神经毒性，也称为ICANS。它们通常在治疗后四天发生。ICANS是在接受CAR-T细胞治疗的患者中并不少见的第二种严重irAE。患者患有脑病和其他不同的症状，例如行为改变、失语症、精细运动障碍和头痛。严重病例可能还需要入住ICU，以便控制癫痫发作并在需要时插管患者，以避免对气道造成任何损害。ICANS可以与CRS一起发生或单独发生，并且在接受CAR-T治疗后最多一个月内发生。它可以是自限性的，症状在17天内解决，或者可能变得严重并导致永久性神经损伤。ICANS的治疗包括给予皮质类固醇和支持性护理。对于神经毒性的治疗，禁忌使用tocilizumab，因为它可能加重症状。由于CRS可以与ICANS一起发生，并且CRS需要用tocilizumab治疗，根据ICANS，如果是低度并且自发解决的，可以开始CRS的治疗并使用tocilizumab。如果ICANS严重并需要积极措施，则首先优先管理ICANS，然后是CRS的管理。
4.2. 最小化细胞因子相关毒性的策略
研究和临床活动不断努力改善CAR-T治疗的结果，同时最小化毒性。为了实现这些目标，提出了新的概念、组合和设计，其中一些活动包括以下内容：
4.2.1. 与其他疗法的结合
基于临床前研究，在CAR-T输注时给予IL-1和儿茶酚胺拮抗剂已显示出减少CRS的发生并最小化其严重程度。正在进行的临床研究正在探索这一概念，同时也在评估对疗效的影响。Dasatinib是一种酪氨酸激酶，被批准用于治疗费城染色体阳性的慢性髓性白血病和ALL。Mestermann等人报告说，dasatinib对CD3ζ域中的淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）具有可逆的抑制作用。当dasatinib在CAR-T疗法输注后三小时给予时，它显著减少了由于CRS导致的死亡发生，在淋巴瘤小鼠模型中。正在进行的临床研究旨在评估dasatinib在不消除可能降低CAR-T疗法疗效的CAR-T细胞的情况下，减少CAR-T输注后CRS的能力。
4.2.2. 新的CAR设计
ON-Switch CAR和OFF-Switch CAR
工程化CAR-T细胞一旦注入患者体内，就会启动一系列杀死目标细胞的免疫反应。然而，这些反应以不受控制的方式继续，导致一系列导致CRS不同症状的免疫毒性。这些炎症细胞因子以不受控制的方式释放，以不同程度的影响不同的器官。ON-Switch CAR是一种将信号域与共刺激域分开的设计。通过添加促进两个分裂CARs组装的异二聚体小分子，可以激活T细胞。此外，可以通过分子剂量改变细胞激活的程度。另一种减少毒性的设计是OFF-Switch CAR，也称为小分子辅助关闭（SMASh）-CAR。SMASh-CAR在CAR结构中包含一个降解域，并在给予蛋白酶抑制剂时使CAR降解，从而降低T细胞活性。相反，在不给予蛋白酶抑制剂的情况下，蛋白酶会切断目标位点以去除降解域并导致CAR的表达。
自杀基因/受体
CAR-T疗法目前是其批准适应症最有效的疗法，但细胞的杀伤能力并不仅限于癌细胞。它可能影响正常细胞，导致非靶向效应和不同的毒性。为了最小化这些毒性，开发了一种旨在选择性破坏转移细胞的基因编码分子。这被称为自杀基因。将自杀基因添加到CAR-T细胞中，可以导致选择性破坏转移的细胞以及选择性消融基因修饰细胞，从而防止CAR-T疗法的非靶向效应和疗法的毒性。有几种经过验证的自杀基因，其中两种在临床环境中研究最多：单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）和可诱导半胱天冬酶-9（iCasp9）。iCasp9自杀基因在暴露于二聚体剂（AP1903）时可以迅速触发凋亡，从而导致T细胞的不可逆终止，可诱导HSV-TK自杀基因通过给予更昔洛韦（GCV）激活。同样，也采用了自杀受体策略；它依赖于在CAR-T细胞表面诱导另一种抗原（例如，CD20）的表达，从而作为“自杀受体”，当注入抗CD20/利妥昔单抗时，将与受体结合并消除CAR-T细胞。
4.3. 靶向肿瘤活性
CAR-T的理想靶标应该只存在于癌细胞上，并且高水平表达。不幸的是，大多数抗原存在于肿瘤细胞和正常细胞上，导致CAR-T细胞疗法针对正常和癌细胞上的抗原。当CAR-T细胞攻击在某些正常组织中共存的抗原时，这就是所谓的“靶向肿瘤”毒性。在接受抗CD19 CARs治疗的患者中，观察到正常B细胞的根除，因为B细胞系在其表面呈现CD19。幸运的是，这种负面影响在一定程度上通过注入丙种球蛋白得到了抵消。然而，在严重情况下，靶向肿瘤毒性可能导致严重的副作用，如多器官功能障碍甚至CAR相关死亡。为了最小化非靶向活性，已经开发了一些新的CAR，通过增强肿瘤特异性。为了实现这一点，研究人员针对两个共表达于肿瘤的抗原。更多细节如下所示。
4.4. 避免靶向肿瘤活性的新CAR设计
在小鼠研究中，针对表达ROR1抗原的肿瘤的CAR-T细胞在淋巴细胞耗竭后导致致命的骨髓衰竭。这是因为针对正常基质细胞上表达的ROR1。开发一种选择性针对肿瘤细胞而不是正常细胞的抗原的CAR-T将提高疗效结果，但避免严重毒性 - 所谓的门控或逻辑门控方法。在临床前研究中，synNotch受体诱导的转录激活是对组合目标 - 抗原识别的响应。然而，需要临床研究数据来定义不同策略在临床实践中的适用性。
4.4.1. 带有“非”逻辑门的双CAR
iCAR的信号域源自免疫检查点，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）。CTLA-4和PD-1是通常在调节性T淋巴细胞（Tregs）和其他免疫细胞上发现的免疫抑制受体。当CTLA-4和PD-1通过结合相应的抗原激活时，将传导抑制信号以减少细胞因子分泌并抑制免疫细胞激活。因此，当iCARs在正常细胞上检测到抗原时，它们将抑制CAR-T细胞的激活，并作为动态控制器以减少靶向肿瘤毒性。
4.4.2. 带有“与”逻辑门的双CAR
合成Notch（SynNotch）系统是一种通过设计带有“与”逻辑门的双CAR来增强CAR-T细胞靶向活性的有效方法。当细胞表面CAR识别目标抗原时，它会触发转录并合成另一种识别不同抗原的CAR。在这种情况下，只有当双重肿瘤抗原存在时，CAR-T细胞才被激活并攻击肿瘤，从而最小化非靶向肿瘤活性。组合CAR，也称为分裂CAR，是另一种用于减少非肿瘤毒性的策略。信号和共刺激域被分割成两个识别不同肿瘤抗原的CAR。因此，为了激活CAR-T细胞，两种目标分子必须同时存在。
5.CAR-T细胞在实体瘤中的挑战及克服策略
尽管实体瘤是所有癌症中数量最多的，但CAR-T细胞疗法仍然不适用于实体瘤。在治疗实体瘤中，这种疗法有几个障碍，包括抗原特异性/异质性、细胞迁移不良和免疫抑制肿瘤微环境（TME）。
5.1. 抗原特异性/异质性
抗原特异性缺乏和抗原异质性是CAR-T细胞治疗实体瘤的重要障碍，导致严重的靶向肿瘤毒性和疗效不足。CAR-T细胞的理想靶标是肿瘤特异性抗原（TSAs），它们在肿瘤细胞上高水平表达，因此不会损伤健康组织。目前已知CD19、CD22和BCMA高度限制于B细胞谱系抗体，接近TSAs。由针对CD19、CD22和BCMA的CAR-T细胞引起的最常见的靶向肿瘤毒性是严重的B细胞再生障碍，但这可以通过静脉注射免疫球蛋白（IVIG）替代疗法治疗。不幸的是，抗原在实体瘤表面表达，大多数血液肿瘤是肿瘤相关抗原（TAAs），也存在于正常“旁观者”细胞上。因此，CAR-T细胞疗法可能引起较少耐受甚至危及生命的毒性。此外，抗原异质性导致不同肿瘤位点的抗原表达水平不同，这阻碍了CAR-T细胞检测肿瘤的能力。
尽管研究人员付出了努力，但在实体瘤中找到最佳抗原并不容易。开发新的CAR可能是一种更可行的方法来克服抗原特异性/异质性障碍。将BiTEs与CAR-T细胞结合可能是解决实体瘤抗原异质性问题的一种方法。如前所述，这种策略允许CAR-T细胞通过改变BiTEs来识别不同的抗原。它已在几个实体瘤模型中进行了临床前研究，并显示出积极的结果。一些新的CAR，如用于减少靶向肿瘤活性的SynNotch受体系统和组合CAR，也可以促进抗原覆盖并增加实体瘤中的抗原选择性，并已在临床前研究中显示出积极的结果。前面提到的通用CAR，用于克服抗原阴性复发，是另一种针对多种抗原以克服抗原异质性的方法。
5.2. 细胞迁移和浸润
CAR-T细胞只有在检测并结合肿瘤细胞表面表达的抗原时才能被激活。对于血液肿瘤，肿瘤细胞是血管中的血细胞。在治疗实体瘤时，CAR-T细胞需要穿透血管内皮层并进入实体肿瘤病变。迁移的成功主要取决于肿瘤细胞分泌的趋化因子与T细胞上的受体（通常是CXCR3和CCR5）之间的正确配对。然而，它们经常彼此不匹配，或者肿瘤细胞产生的CXCR3和CCR5配体太少，阻碍了T细胞的迁移和浸润。改善迁移问题的策略之一是局部递送。
5.3. 肿瘤微环境
肿瘤微环境（TME）是由肿瘤细胞创造的独特环境，其中观察到低pH、缺氧和营养缺乏。此外，TME往往比正常组织具有更多的抑制性可溶性细胞因子、抑制性免疫细胞和抑制性免疫检查点（例如，PD-1和CTLA-1），阻碍T细胞活性。为了减少抑制性免疫细胞的数量，使用阻断抗体是重塑TME的策略之一。然而，预处理化疗可能不是实现这一目的的最理想方式，因为它也会抑制T细胞活性。更好的策略是使用仅针对免疫抑制细胞的抗体，如抗调节性T细胞（Tregs）抗体和抗髓源性抑制细胞（MDSCs）抗体。同样，阻断抗体也可以用来降低抑制性细胞因子的水平，特别是TME中的主要细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β）。另一种选择是通过基因编辑敲除T细胞上的TGF-β受体。
免疫检查点是免疫系统的安全调节器，防止过度的免疫反应损害体内的正常细胞。然而，一些肿瘤细胞可以通过分泌配体来上调T细胞上的免疫检查点数量并刺激它们，以限制T淋巴细胞活性。因此，将CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂（ICIs）结合可能是一种增强T细胞介导毒性的策略。目前，市场上有几种ICIs，如CTLA-4抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂。另一种策略是通过基因修饰敲除CAR-T细胞上的PD-1表达。其他新的CAR设计，如装甲CAR-T细胞和第四代CAR-T细胞（TRUCKs），是基因工程CAR，可以产生细胞因子，这可以刺激免疫反应并调节TME。在注入“装甲CAR-T细胞”后的小鼠模型中观察到对Tregs的内在抗性，这些细胞分泌IL-12，这是一种可以激活免疫细胞的促炎细胞因子。第四代CAR与装甲CAR-T细胞的不同之处在于它们在设计上更加灵活。它们只在检测到目标抗原时开始合成刺激性细胞因子。第四代CAR已在各种实体瘤的临床前模型中进行了测试，并显示出显著的疗效。
5.4. 实体瘤的CAR-T研究
CAR-T疗法已评估用于治疗不同类型的实体瘤，例如结直肠癌（CRC）、乳腺癌（BC）、胸部肿瘤、肝细胞癌（HCC）和卵巢癌。本综述将重点关注四种常见的肿瘤类型以及CAR-T疗法在其中的治疗试验。在CEA阳性CRC中：针对癌胚抗原（CEA）特别开发了CAR-T，CEA是大多数CRC中表达的肿瘤标志物。目前，有几项正在进行的I期研究正在评估CEA导向CAR-T疗法在晚期CRC中的安全性和疗效。这些研究的结果仍在等待中。来自CRC患者的病例报告的最小数据表明，患者在肝脏内完全代谢反应持续了13个月，I期研究的初步结果表明，在15名接受CAR-T疗法的不可切除转移性CRC患者中，有2例部分缓解，9例病情稳定。在I期试验中，前列腺癌患者接受了淋巴耗竭化疗，随后接受了CAR-T疗法，作为连续输注，剂量逐步增加。治疗是可容忍的，5名患者中有2名（40%）实现了部分缓解（PR）和前列腺特异性抗原（PSA）下降50-70%。另一名患者对治疗有轻微反应。
在肝细胞癌（HCC）中，针对潜在的抗原靶标，即肝细胞癌-3（GPC3），开发了CAR-T。在两项评估CAR-T疗法对GPC3+ HCC效果的I期研究中，患者接受了环磷酰胺和氟达拉滨基础的淋巴耗竭输注。共有13名患者参加了研究，其中9名（69%）遭受CRS。没有3/4级神经毒性。总生存率（OS）在6个月时为50.3%，1年时为42%，3年时为10.5%。值得注意的是，研究中的一名患者病情稳定，存活了44个月。在另一项I期研究中，晚期转移性实体瘤患者接受了针对CD133的CAR-T治疗。该研究招募了不同实体瘤的患者，其中包括23名HCC患者。3名患者实现了PR（13%），14名患者实现了病情稳定（SD）（61%）。中位无进展生存期（PFS）为5个月，3个月疾病控制率为65%。对于胸部癌症的治疗，目前正在评估多种靶标，包括EGFR、HER2、MSLN、MUC1、CEA、ROR1和PD-L1，用于肺癌的CAR-T细胞疗法。在这些中，EGFR和MSLN特异性CAR-T细胞由于抗原的特异性更高且靶向肿瘤毒性担忧较低，似乎比其他细胞更有前景。
一项开放标签的I期研究调查了局部递送自体间皮素靶向CAR-T与pembrolizumab治疗恶性胸膜间皮瘤（MPM）。基于临床前工作，pembrolizumab被给予，该工作表明PD-1阻断可以增强间皮素CAR-T活性并挽救耗尽的CAR-T细胞的功能。在这项研究中，27名恶性胸膜疾病患者（无论是原发还是胸膜转移）接受了胸腔间皮素靶向CAR-T；其中25名患者被诊断为恶性胸膜间皮瘤（MPM），其中18名患者在CAR-T细胞疗法后接受了pembrolizumab。基于27名患者中23名接受胸腔间皮素靶向CAR-T的中位总结果，然后是接受pembrolizumab和CAR-T疗法的18名患者的中位总结果。在20个月的中位随访中，CAR-T治疗的中位OS为17.7个月，1年生存率为74%。Pembrolizumab每3周给予一次，以促进CAR-T功能。随着pembrolizumab的添加，患者的结果得到了进一步的增强，中位OS为23.9个月，1年生存率为83%。
6.未来的CAR基础细胞疗法：现成CAR和下一代CAR
自体CAR-T细胞在临床上取得了显著的成果，并戏剧性地改变了血液癌症的治疗。然而，仍然存在一些问题阻碍患者接受CAR-T细胞疗法。除了前几节提到的CAR-T疗法的疗效和安全性问题外，高成本、复杂流程以及大约需要3周时间制造个性化T细胞的等待时间也是阻碍患者接受治疗的因素。因此，为了克服这些障碍，正在开发通用的异体CAR-T细胞（也称为“现成”CAR-T细胞）和其他使用替代效应细胞的CAR。
6.1. 现成CAR-T细胞
与自体CAR-T细胞相比，现成CAR具有许多潜在的好处。首先，可以选择健康捐赠者作为免疫细胞的来源来生成它们。
这可能会导致CAR-T细胞表现更好，因为来自健康捐赠者的免疫细胞没有受到癌症影响或暴露于化疗药物。一些临床和临床前研究表明，从患者身上提取的T细胞的质量和数量会影响CAR疗法的疗效。此外，与未经输注的患者相比，接受化疗的患者更有可能拥有质量较差的T细胞，以及数量不足的T细胞，这可能与CAR-T细胞活性不足和无法收获足够的细胞进行CAR-T制造有关。其次，与生产个性化自体CAR-T细胞的耗时过程不同，可以从单个捐赠者那里产生大量的异体CAR-T细胞，生产出一批保存的CAR-T产品，使患者能够立即接受治疗。
此外，通过大规模生产过程可以显著降低CAR-T疗法的价格。然而，令人担忧的是，如果免疫细胞来源于MHC不匹配的捐赠者，现成CAR-T产品可能会导致移植排斥和移植物抗宿主病（GVHD），这可能是致命的。GVHD是一种不利的免疫反应，发生在给予异体CAR-T细胞时，这是由于宿主免疫系统的“非自我”识别。此外，GVHD可能会导致异体CAR-T细胞的抗肿瘤活性降低，因为它们可能被宿主免疫细胞消灭。已经在临床前和临床研究中测试了几种不同的T细胞来源，以克服GVHD，如病毒特异性T细胞、基因修饰的常规T细胞和非常规T细胞。
使用病毒特异性T细胞可能是降低GVHD风险的潜在方法，因为它们长期以来一直被用来治疗移植后的病毒感染。在I期试验中的安全性已经得到证明，在给予B细胞癌症患者的CAR病毒特异性T细胞的患者中没有报告严重GVHD。T细胞受体（TCR）主要负责识别外来物质和宿主细胞之间的MHC分子。因此，使用基因修饰去除内源性分子，如αβ TCR和MHC，是克服GVHD和排斥问题的另一种潜在策略。在临床研究中，两名患有R/R ALL的婴儿成功接受了通过转录激活样效应子核酸酶（TALEN）基因工程产生的通用CAR-T细胞治疗。目前正在研究将CAR引入各种T细胞亚型。伽马-德尔塔T细胞（γδ T细胞），占T细胞总数的约5-10%，是最有前途的现成CAR生产候选者之一，因为γδ T细胞表面的γδ TCR是不依赖MHC的，从而降低了GVHD的风险。此外，在概念验证研究中已经证明了CAR-γδT细胞治疗实体瘤的前景，其中CAR-γδT细胞显示出额外的抗肿瘤活性，而内在的γδT功能仍然存在。
6.2. 下一代CAR细胞
尽管CAR-T疗法在血液肿瘤中取得了巨大成功，但其毒性和上述其他限制显著阻碍了患者接受治疗及其在实体瘤治疗中的扩展。鉴于这些缺陷，人们越来越感兴趣，并正在进行大量研究，以寻找CAR细胞疗法的替代效应细胞。NK细胞和巨噬细胞是制造下一代CAR的两个有希望的候选者，因为它们具有有利的特性。与T细胞不同，它们是先天免疫系统的成员，可以在没有MHC的情况下直接识别目标细胞，并且不会引起GVHD。因此，它们也是生产现成CAR的可能选择。
NK细胞比CAR-T细胞有几个优势，其中一个是它们即使在MHC分子下调时也能识别肿瘤细胞，从而避免抗原逃逸。此外，NK细胞可以从各种异体来源中提取，如诱导多能干细胞（iPSC）或脐带血，因为NK细胞的激活不需要经过MHC途径。CAR-NK在各种血液和实体瘤的临床前模型中的抗肿瘤活性已经得到证明。此外，在一项招募了11名CD-19阳性血液肿瘤患者的I/II期临床研究中，在给予异体CAR-NK细胞后没有报告显著毒性。在clinicaltrials.gov上注册并且正在进行或招募的基于CAR-NK的临床研究在表3中显示。
巨噬细胞代表另一个有独特特征的有希望的候选者。首先，它们可以通过选择性吞噬作用攻击肿瘤细胞，并将抗原呈递给T细胞以激活适应性免疫。第二，巨噬细胞是肿瘤微环境中最丰富和最高度浸润的先天细胞。最后，它们可以产生趋化因子或细胞因子，因此作为主要的免疫调节剂来重塑抑制性肿瘤微环境。在临床前研究中，CAR巨噬细胞成功地在体外摧毁了癌细胞，并在两种不同的实体瘤的小鼠模型中减少了肿瘤负担，从而提高了OS。其他研究表明，CAR巨噬细胞促进了促炎细胞因子的分泌，并增强了T细胞对肿瘤的细胞毒性活性[77]。值得注意的是，基于CAR-M的I期临床研究已在clinicaltrials.gov上注册并开始招募（表4）。
7.讨论：CAR-T细胞疗法当前的挑战和未来发展动态
7.1. 目标抗原选择
由于其出色的临床结果，更多的研究投入到了这种疗法的开发中。然而，CD19仍然是最受欢迎的目标抗原，因为Kymriah作为第一个抗CD19 CAR产品在2017年获得批准。尽管一些靶标的表达模式，如CD20、CD22和BCMA，与CD19相似，但它们并没有像CD19那样成功。一个可能的原因是CD19的表达比其他靶标更稳定，导致抗CD19 CAR在临床应用中具有更强的抗肿瘤活性。2021年第一个非CD19导向的CAR Abecma的批准突显了为CAR-T细胞疗法寻找理想靶标的困难。令人鼓舞的是，第二年批准了第二个非CD19导向的CAR Carvykti。Abecma和Carvykti都是抗BCMA CAR-T细胞。
7.2. 疗效、安全性和临床应用扩展
CAR-T细胞疗法彻底改变了几种血液癌症的治疗方法，这些癌症曾经没有合适的治疗选择。然而，鉴于这种迫切的未满足医疗需求，CAR-T细胞疗法的批准是基于相当短的研究持续时间、较弱的主要终点和与传统肿瘤学试验相比有限的患者数量。目前市场上的CAR-T细胞产品在I/II期或II期试验中进行，采用开放标签和单臂实验设计。因此，已经注意到设计的某些缺点。首先，这些试验的受试者不到1000人，随访时间不到两年。其次，大多数研究的主要终点是总缓解率（ORR）、完全缓解（CR）率或缓解持续时间（DOR），而不是更有力的终点，如OS或PFS。最后，单臂设计没有对照组来评估预处理化疗对患者的影响了CAR-T细胞输注前的影响程度，或者有多少抗肿瘤反应归因于CAR-T细胞疗法。因此，需要进行更大规模的研究，采用时间到事件终点，并有足够的患者随访时间。
CRS和神经毒性是潜在的危及生命的严重不良事件，极大地限制了CAR-T细胞疗法。由于对因果关系确切机制的理解不足，两者仍然无法预测。认为需要开发更具信息量的临床前模型，以更好地理解这些毒性。此外，每个研究中心都有自己的分级工具和治疗指南来评估这些毒性，这使得数据收集和安全性评估变得困难。令人鼓舞的是，ASTCT共识分级在2018年作为与免疫效应细胞相关的CRS和神经毒性的共识分级系统发布。
令人鼓舞的是，正在开发新的CAR设计来克服上述挑战，其中一些设计在临床前或临床研究中显示出积极结果。带有AND门的双CAR是一种有希望的策略，可以扩大抗原覆盖范围，而带有NOT门的双CAR可以通过作为CAR-T细胞抗肿瘤活性的控制器来减少毒性。一些创新的CAR具有分泌免疫调节分子的能力，可以增加T细胞功能并调节TME，以恢复T细胞的抗肿瘤活性。然而，需要更多时间来适当评估这些新CAR-T设计的有效性和安全性。
7.3. 治疗费用
CAR-T细胞疗法的显著成果被认为是临床成功；然而，在商业方面，CAR-T细胞疗法取得了最小的成功。CAR-T细胞疗法的费用是患者接受治疗的重大障碍，因为制造过程复杂、高度个性化且耗时。例如，Kymriah的单次输注费用为475,000美元，Yescarta的费用为373,000美元，不包括住院治疗副作用。如此高的价格对个人和医疗保健系统都是财务负担，限制了需要它的患者接受CAR-T治疗的机会。
7.4. 未来展望
尽管CAR-T细胞疗法的发展仍然面临许多挑战和障碍，但注册临床研究数量的持续增加表明该领域正在蓬勃发展。新的CAR-T细胞设计和新的CAR，如CAR-NK和CAR-M，显示出治疗实体瘤的潜力。CAR-NK和CAR-M的独特特性也使它们成为开发现成CAR产品的有希望的候选者。因此，相信通过新兴研究，CAR基础细胞疗法将继续得到发展和优化，并将在未来使更多的癌症患者受益。
8. 结论
CAR-T细胞疗法已经显示出出色的临床成果，并显著改变了以前没有太多治疗选择的各种R/R血液肿瘤的治疗方法。然而，高昂的治疗费用给患者和支付者带来了沉重的负担，从而阻碍了它的商业成功。此外，高复发率、肿瘤抗原逃逸和严重的CAR相关毒性是未解决的问题。尽管如此，CAR技术的不断发展、新的CAR开发和下一代CAR，如CAR-NK和CAR-M，以及基于CAR的免疫疗法都有望克服目前的限制，在癌症治疗中实现更安全、更有效、更广泛的应用。同样重要的是，CAR-T疗法是负担得起的，以便更多的患者可以使用它。这将有助于增加我们对CAR-T疗法在实践中的疗效和安全性的了解。
