杜克大学最新发文 | 全面比较DNA和mRNA疫苗

导读：核酸技术的发展使得RNA和DNA疫苗的快速设计和生产成为可能，而COVID-19 mRNA和DNA疫苗的成功部署进一步验证了上述技术。目前，市场上mRNA相对盛行，但DNA技术也正在快速发展。

2024年5月，杜克大学Fan Yuan教授团队在Advanced Drug Delivery Reviews（一区，IF=15.2）上发表题目为“A comprehensive comparison of DNA and RNA vaccines”的综述文章，系统比较了目前文献中已知的mRNA和DNA疫苗在开发时间表、财务成本、运输、疗效、安全性和产品监管批准诸多方面的优缺点，极大的方便了研究人员快速了解这两种疫苗平台的近期表现与它们未来的临床潜力。此外，本综述还讨论了正在进行的临床试验、改进策略以及用于疫苗接种的RNA和DNA平台的替代设计。

RNA和DNA疫苗都是通过使用宿主自身的蛋白质合成机制产生“抗原”来发挥作用的，这个过程模仿自然感染而不会引起疾病，使身体能够以可控的方式产生免疫力。DNA疫苗通常是通过将抗原编码基因片段克隆到环状载体，可在哺乳动物细胞中有效表达，修饰后的DNA构建体通过肌肉注射和皮内注射等途径输送到宿主体内。宿主细胞将吸收DNA，读取其序列中的遗传信息，并合成编码的抗原（图 1）。在许多临床试验中，单独的裸DNA已被用作疫苗直接注射到宿主体内，并被证明是有效的。

RNA疫苗则为RNA携带产生抗原所需的遗传信息，在抗原呈递细胞的帮助下，产生被宿主免疫系统识别的抗原，以激活免疫反应。RNA疫苗通常包封在脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP）中，这有助于保护RNA并促进其进入细胞和内体逃逸。RNA被注射部位附近的细胞吸收后，从LNP中释放出来并进入细胞的胞质溶胶，进行随后的翻译和呈递过程。

图 1 mRNA和DNA疫苗的作用机制

2.1 开发周期和成本

mRNA和DNA疫苗的设计和生产相关周期和成本取决于病原体类型、监管要求等诸多因素。初始步骤均为抗原基因序列开发(图 2)。

对于DNA疫苗，基因序列将被克隆到DNA载体中，并伴随着选定的启动子和增强子以实现优化转录。DNA载体首先在细菌中扩增，然后从细菌培养物中收获。分离和纯化后，将它们重新溶解在水溶液中以便于给药。

mRNA疫苗的设计除了需要相同的基因序列鉴定初始步骤，并额外增加了质粒线性化、体外转录反应、加尾、加帽等步骤。同时，mRNA疫苗的开发也需要根据目标组织/器官和细胞类型、mRNA大小和序列、所需的佐剂和可接受的炎症水平进行LNP配方的设计和筛选，以用来保护mRNA不被降解。此外，LNP中常用的可电离脂质等材料较为昂贵。

图2 mRNA/DNA 疫苗的生产工艺流程差异

2.2 运输和存储要求

为了防止mRNA和LNP的结构变化，mRNA疫苗必须保持在（超）低温下才能长期储存和运输。Moderna和辉瑞目前针对COVID-19的mRNA疫苗要求分别在-15 ~ -25 °C和-60 ~-90 °C的温度下冷冻储存。对于短期储存，Moderna mRNA COVID-19疫苗在室温下可稳定长达12小时，在2-8 °C下可稳定30天。辉瑞-BioNTech mRNA COVID-19疫苗在室温下可稳定长达2小时，在2-8 °C下可稳定长达5天。但（超）低温会增加储存和运输成本，并限制了mRNA疫苗在全球所有地区或国家的可及性。目前，这一问题的潜在解决方案是冻干mRNA-LNP。DNA疫苗则由于其卓越的热稳定性易于运输和储存，减轻了与冷链要求相关的挑战。

2.3 剂量和保护效果

与mRNA疫苗相比，目前的DNA疫苗疗效较低，并且在临床试验中需要更高的剂量才能产生有效的免疫反应。对于针对COVID-19的初始疫苗接种，辉瑞的mRNA疫苗分为两剂，每剂30μg，Moderna mRNA疫苗包括两剂100μg。相比之下，ZyCoV-D则被批准为三剂量方案，每剂方案含有2 mg质粒DNA。两种疫苗之间的大剂量差异主要是由于抗原生产开始前DNA递送的细胞内障碍较高。相比之下，mRNA疫苗在翻译成靶抗原之前不需要到达细胞核，LNP制剂中的可电离阳离子脂质可以极大地促进细胞表面的跨膜转运和mRNA在细胞内的内体逃逸。

2.4 安全性和不良事件

mRNA和DNA疫苗的相关不良事件（Adverse Event, AE）通常与注射核酸、水溶液和LNP等外来物质有关。大多数mRNA或DNA疫苗接种相关AE的强度为轻度至中度，而且DNA有着更好的安全性。同时，由于LNP中含有非天然脂质可能会引发mRNA疫苗的超敏反应。而DNA疫苗也存在不安全性，由于需要进入细胞核进行抗原表达，因此存在被整合到受体细胞基因组中的可能性。mRNA和DNA疫苗的另一个潜在安全问题与重复接种疫苗有关，可能诱导系统性自身免疫性疾病有关。

3.1 临床试验进展

3.1.1 mRNA疫苗的临床试验

随着COVID-19 mRNA和DNA疫苗的胜利，核酸疫苗临床试验的数量和规模显著增加。近年来，mRNA疫苗参与了各种靶点的临床试验，包括流感、疟疾、呼吸道合胞病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、结核病、狂犬病和寨卡病毒等。此外，mRNA疫苗已在临床上进行了癌症治疗测试，例如非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、胃肠道癌、三阴性乳腺癌、卵巢癌等。目前共有301项mRNA疫苗临床试验正在进行中，15项试验已终止或暂停，129项试验已完成。他们中的大多数处于临床Ⅰ期、Ⅱ期或Ⅰ/Ⅱ期。

图3 mRNA/DNA疫苗技术的临床应用

3.1.1 DNA疫苗的临床试验

DNA疫苗临床试验的传染病方向包括SARS-CoV-2、寨卡病毒、乙型肝炎、流感、HIV等。值得注意的是，DNA疫苗在治疗癌症的临床试验中有着相对较长的历史，例如三阴性乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、人瘤病毒、宫颈癌和卵巢癌。

3.2 疫苗的改进

3.2.1 mRNA疫苗的改进

mRNA疫苗的改进主要集中在RNA及其序列修饰、LNP递送系统、抗原的选择、组合和佐剂上。非翻译区（Untranslated Regions, UTR）、帽结构、开放阅读框和poly（A）尾这些mRNA结构元件一直是改进的目标。为了降低mRNA免疫原性并提高翻译效率，通常使用5-甲基胞苷和假尿苷核苷酸等碱基进行修饰。修饰后能够帮助mRNA逃避干扰素诱导的抗病毒途径，降低mRNA的降解并减少与之相伴的不良炎症反应。其他修饰，如必要的密码子优化，在哺乳动物细胞中用常用的密码子替换稀有密码子可以增加抗原的产生。

此外，LNP的优化与筛选，也是mRNA疫苗改进的一大方向。除了保护mRNA免受生理环境中的核酸酶降解和克服细胞内递送障碍外，还观察到LNP对某些mRNA疫苗表现出很强的佐剂性。但为避免上述LNP的不良影响并提高靶向性，不少学者也在探索诸如细胞外囊泡、合成聚合物等mRNA递送的新替代策略。

3.2.2 DNA疫苗的改进

DNA疫苗的改进大致可分为四类：抗原选择和组合、DNA构建体设计、DNA递送和佐剂掺入。DNA构建体设计包括优化抗原的密码子组成，将不同序列的最佳组合用于用单个载体递送一些抗原或融合蛋白，以及掺入特异性启动子、增强子和DNA核靶向序列。

DNA比mRNA更难递送，电转是迄今为止最有效和最方便的一种方法，越来越多地用于人体临床试验，以提高DNA疫苗对不同疾病的疗效。同时，基因枪、脂质、聚合物和无机材料也是DNA疫苗递送的新方向。此外，佐剂的加入可以增强DNA疫苗中APC活化以及T细胞吸引和极化。佐剂可以是明矾等化学物质，也可以是免疫刺激性遗传物质。常见的佐剂还包括促炎细胞因子，细胞因子可以作为蛋白质直接添加，也可以通过与DNA疫苗共同给药的表达载体编码。

3.3 核酸疫苗的替代设计

3.3.1自扩增RNA疫苗

自扩增RNA（self-amplifying RNA, saRNA）是非复制mRNA的替代平台，它旨在解决传统mRNA疫苗抗原产生不足的问题。数据表明，saRNA疫苗的剂量需求方面明显低于传统mRNA疫苗，因此允许节省剂量的同时，保证更好的耐受性和更低的制造成本。saRNA包含源自甲病毒的复制子。它们可以以病毒复制子颗粒的形式递送，并将saRNA包装在病毒颗粒中。目前，saRNA也采用类似于mRNA递送中使用的各种非病毒制剂，如阳离子脂质、LNP、聚合物和硫酸鱼精蛋白，以及电穿孔等物理技术。

图4 常规mRNA疫苗与saRNA和circRNA疫苗的比较

3.3.2 mcDNA和纳米质粒DNA疫苗

与传统质粒DNA疫苗相比，mcDNA（minicircle DNA）消除了细菌扩增所必需的原核序列，从而更小却可以实现更高的基因递送效率和编码抗原表达。mcDNA疫苗也比质粒DNA疫苗更安全，因为它们避免了对宿主免疫系统识别的原核序列炎症反应，并防止受体获得由质粒DNA中包含的抗生素选择标记基因诱导的抗生素耐药性。然而，复杂的生产和纯化过程以及与制造相关的高成本目前限制了mcDNA在疫苗接种中的使用。mcDNA通常是通过重组酶和限制性内酶在大肠杆菌中的分子内重组产生的，这些酶被诱导型基因表达系统激活。重组酶促进识别序列的位点特异性重组，从而形成两个环状DNA分子。

纳米质粒使用RNA/RNA相互作用非编码选择标记系统来消除传统质粒骨架中对抗生素抗性标记的需求。由于其骨架小（<500 bp），纳米质粒载体在体外和体内表现出强大的转染效率，比使用传统质粒DNA高出十倍。由于这两个优势，它们已在临床前研究中用作流感、委内瑞拉马脑炎病毒和埃博拉病毒的疫苗，并显示出更强的免疫反应。

核酸疫苗是一个令人兴奋的新领域，其应用范围包含预防各种传染病以及治疗癌症。核酸疫苗在有效性、安全性、简单性、快速设计和制造方面具有多项优势。

本综述从诸多方面系统比较了mRNA和DNA疫苗，当前mRNA疫苗似乎比DNA疫苗具有临床影响。目前，RNA和DNA疫苗都在快速发展，这两个平台中都出现了令人兴奋的新技术，这些技术将影响未来疾病的预防、治疗和控制。同时，由于RNA和DNA疫苗在临床开发和使用中的历史相对较短，因此需要更多的研究来优化平台，收集长期疗效和安全性数据。

[1] Wang C, Yuan F. A comprehensive comparison of DNA and RNA vaccines. Adv Drug Deliv Rev. 2024 Jul;210:115340. doi: 10.1016/j.addr.2024.115340.

识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入

生物制品微信群！