导读：mRNA是一种新型的疫苗技术，mRNA的制备、质量检测和活性评估手段在近三年获得了飞速发展。
2024年5月，美国顶尖教学医院西奈山伊坎医学院Nicolas Vabret团队在Cell子刊STAR Protocols分享实验方法：Protocol for the development of mRNA lipid nanoparticle vaccines and analysis of immunization efficiency in mice。文章详细描述了mRNA疫苗的制备和体内外活性评估实验步骤，包含：mRNA序列设计、转录模板DNA制备、mRNA制备、mRNA-LNP包封、RNA质量检测和mRNA疫苗的免疫原性评估（体外细胞和体内小鼠试验）。
菌菌详细阅读了这篇文献，并将分期介绍给大家。本期文章菌菌将解读mRNA疫苗的序列设计部分。
01
mRNA关键元件的设计
研究人员描述了一种由脂质纳米颗粒（LNP）包封的mRNA疫苗，其mRNA序列包括5'非翻译区（5’ UTR）、编码序列（5种抗原和1个报告基因）、3’ UTR和多聚腺苷酸化（PolyA） 尾。此外，他们在5’ UTR的上游设计了一个腺嘌呤(A)核苷酸，以便于使用CleanCap AG帽类似物实现共转录加帽。
1.1 UTR序列设计
5’ UTR和3’ UTR序列对于mRNA的稳定性和翻译至关重要。在mRNA疫苗的设计过程中，5’ UTR和3’ UTR序列通常来自目标物种体内高表达基因的UTR，以促进有效翻译，如α-珠蛋白基因；或者通过指数富集（SELEX）的方式来实现 5’ UTR的系统演化。
例如，BNT162b2直接选取了人alpha珠蛋白基因的5’ UTR，同时针对Kozak序列进行了优化，具体为使用GCCACCAUG替换了ACCAUG。BNT162b2的3’ UTR由两个片段组成，分别来自人类线粒体12S rRNA（mtRNR1）和人AES/TLE5基因。
而Moderna基于SELEX方法全新设计了mRNA-1273的5’ UTR序列，序列中包括公认最优的Kozak序列GCCACCAUG。mRNA-1273采用了人源alpha珠蛋白的 3’UTR。
这篇文章中，研究人员在mRNA疫苗的序列设计中提供了以上两种示例的UTR序列，即来自BioNTech/辉瑞疫苗BNT162b2和Moderna疫苗mRNA-1273的UTR序列。
不同的5’UTR序列可能适用于不同的编码序列、不同的物种、不同的靶细胞。为此，耀海生物mRNA制备平台建立了丰富的天然UTR库、突变UTR库，为客户CDS序列定制化筛选最适合的UTR序列。如感兴趣可随时联系菌菌：133 8033 2910。
1.2 Poly(A)序列
Poly(A)尾巴同样促进mRNA的稳定性和翻译效率，poly(A)可以在DNA模板中编码或在体外转录（IVT）后添加。Poly(A)长度通常在120 nt左右，可以是纯腺苷（A）序列或者分段式序列。
在该Protocol中，作者采用了分段式尾巴，包括一个30个A、10个非纯A序列（GCATATGACT），最后是70个A。
耀海内部研究数据显示，使用DNA模板添加polyA可以更加精确地控制mRNA的长度。经过工艺优化，我们目前能够将polyA尾控制在目标长度±5 nt。
1.3 编码序列（CDS）
该mRNA疫苗的CDS区域由多个抗原编码序列串联组成，包括小鼠共享肿瘤相关抗原、肿瘤新抗原和源自卵清蛋白（OVA）抗原表位，抗原序列之间用10聚甘氨酸-丝氨酸（GS）接头连接。
在克隆到 mRNA 编码质粒之前，研究人员使用GENEWIZ生物信息学软件工具对抗原编码序列进行了密码子优化。
02
其他元件的设计
体外转录（IVT）是一种基于模板的过程，RNA聚合酶（RNAP）通过识别模板序列中的噬菌体启动子序列后，启动RNA转录本的生成。
可选的RNA聚合酶包括T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶，与之对应的，模板序列需具备T7启动子和SP6启动子。该Protocol中使用了最为广泛使用的T7启动子。
为保证生成预期长度和序列的mRNA转录本，应考虑在质粒模板中设计独特的限制性内切酶位点，用于在mRNA编码序列的下游（即polyA/T下游）实现质粒DNA的线性化。
在这篇Protocol中，作者整合了一个IIS型限制性内切酶识别位点（BsPQI），该位点在polyA 尾的3'末端进行切割。
IIS型限制酶是理想的mRNA质粒模板线性化酶，这类酶可以在识别位点的下游特定距离处切割DNA双链，也就是说IIS型限制酶对切割位点的序列没有要求，有利于保证mRNA序列的完整性。
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