中山大学 | 基于流感病毒NA抗原的circRNA多价疫苗

导读：血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是流感包膜上的两种主要糖蛋白。NA是流感病毒包膜上第二丰富的糖蛋白，可在流感复制周期中促进病毒释放。流感疫苗目前的有效性主要通过其诱导血凝抑制抗体反应的能力来证明。然而，季节性流感病毒通常表现出对此类免疫反应的显著免疫逃避。

近年来，人们越来越认识到 NA 特异性免疫在赋予交叉保护方面的关键作用。NA 的突变率比 HA 蛋白慢，HA 蛋白容易发生快速抗原漂移。天然流感病毒感染在人类中诱导了很高比例的NA 反应性 B 细胞和广谱型 NA 抗体。这些 NA 反应性抗体在体外表现出强大的 NA 抑制活性，保护小鼠免受致命攻击。此外，最近的研究表明在 NA上发现了大量保守的中和表位。对豚鼠和人类的研究表明，抗 NA 免疫可以阻碍病毒传播。因此，NA是广谱流感疫苗开发的潜在靶标。

近日，中山大学公共卫生学院（深圳）陈耀庆教授、舒跃龙教授、湖南大学郑克威教授共同在在 npj Vaccines发表文章：CircRNA based multivalent neuraminidase vaccine induces broad protection against influenza viruses in mice，他们利用circRNA表达流感病毒NA抗原，包含三种亚型NA抗原，分别为甲型流感 N1、N2 和乙型流感维多利亚谱系 NA。单个circRNANA LNP诱导具有神经氨酸酶抑制活性 （NAI） 的强烈 NA 特异性抗体反应，从而阻止病毒排出并感染邻近细胞。此外，circRNA^NA LNP还可诱导小鼠细胞免疫。三价circRNA^NA 流感疫苗免疫小鼠不仅引发了针对所有三种 NA 亚型的平衡抗体反应和 Th1 偏向性免疫反应，而且还可以保护小鼠免受同源病毒和不同源的 H1N1、H3N2 和 B 型流感病毒的致命挑战，包括流行的和原始的流感病毒株。这项研究说明circRNA-LNP技术可作为多价NA流感病毒疫苗的递送平台，是通用型流感疫苗开发的有效策略。

从三种流行的季节性流感疫苗株中选择 NA抗原：A/Michigan/45/2015 （H1N1）、A/Switzerland/9715293/2013 （H3N2） 和 B/Florida/12/2017 。利用PIE环化策略制备circRNA ^NA，凝胶电泳和测序证实circRNA的生成。三种类型的circRNA ^NA-LNP理化性质表现出一致性，粒径为 ~80 nm，PDI< 0.2，包封效率超过93%。

circRNA ^NA-LNP转染 HEK293T 细胞，流式检测表明大约 98% 的转染细胞中具有稳定的 NA 表达，表明 circRNA 的蛋白质翻译有效。为了验证 circRNA 产生的 NA 抗原是否具有功能，使用MUNANA作为底物检测转染 circRNA-LNP 的细胞的 NA 活性。阳性酶活性证实 circRNA 产生的 NA 抗原具有天然构象。

用三种单价circRNA ^NA疫苗免疫小鼠，剂量分别为10 μg 或 2 μg，每剂间隔 4 周。在初次和加强疫苗接种后，所有三种疫苗都以剂量依赖性方式引起了 NA 特异性血清IgG抗体水平的显着增加。circRNA ^NA疫苗免疫血清的结合广度表明，单价疫苗可以诱导针对同一 NA 亚型内异源 NA 的特异性抗体。

鉴于 NAI 抗体滴度与免疫保护之间的潜在联系相关性，测定针对同源 NA 的 NAI 抗体。结果显示，增加 circRNA^NA疫苗剂量，显著增加NAI 滴度。这说明加强疫苗接种对于刺激 NA 特异性 B 细胞的成熟和功能抗体的产生可能是必要的。

为了进一步评估疫苗的有效性，进行了微量中和试验 （MN 测定） 以评估免疫血清在体外抑制流感病毒复制的能力。结果显示，所有加强免疫小鼠的血清均表现出显著的病毒中和活性。由于 NA 抗体不直接中和病毒感染，因此 MN 实验中使用的免疫血清可能通过抑制病毒释放和邻近细胞的后续感染来抑制病毒。

总体而言，上述数据证实，含有 NA 抗原的 circRNA 疫苗具有很强的免疫原性，可在小鼠体内诱导 NAI 和中和抗体。

除了引发强烈的体液反应外，细胞免疫还有助于增强疫苗的保护功效。收集免疫后的小鼠脾脏细胞，酶联免疫吸附斑点 （ELISpot）检测表明三种 circRNA 疫苗都显着增加了产生IFN-γ和IL-4的细胞数量。

用重组N1、N2 或流感乙型病毒（IBV）NA 蛋白刺激后，circRNA疫苗免疫小鼠中检测到产生IFN-γ、TNF-α 和IL-2的CD4⁺ T细胞。circRNA-N1 、 circRNA-N2及circRNA-IBV-NA 免疫的小鼠中检测到分泌IFN γ的 CD8⁺ T 细胞。

总体而言，这些数据表明 circRNA-NA 疫苗可以在小鼠中诱导 NA 特异性的 T 细胞反应，包括 CD4 + 和 CD8 + 亚群。

用三价 circRNA-LNP 疫苗（包含N1、N2 和 IBV 三种不同的的抗原）免疫小鼠，30 μg（每个 NA 10 μg）和 6 μg（每个 NA 2 μg），间隔免疫时间为4周。

血清抗体滴度表明，三价 circRNA 疫苗诱导了针对所有三种 NA 成分的平衡和强大的抗体反应，达到与单价疫苗类似的血清抗体滴度水平。更加重要的是，三价 circRNA 疫苗的高剂量组和低剂量组触发的血清抗体滴度水平无显著差异，可能是由于三价 circRNA 疫苗在小鼠中的免疫剂量达到饱和。

值得关注的是，三价 circRNA 疫苗免疫小鼠引起了更广泛的抗体识别，包括所有异源 N1、N2 和 IBV 毒株，超过了单价疫苗反应，尤其是在高剂量组中。此外，三价疫苗血清在体外表现出针对三种 NA 亚型及其各自病毒的中和作用。

为了评估体内保护作用，接种三价 circRNA 疫苗的小鼠在加强后 28 天用致死剂量的各种流感毒株进行攻击。针对同源 H1N1 毒株（A/California/04/2009），两剂三价疫苗完全保护了所有小鼠，体重减轻最小 （~5%）。针对更遥远的 H1N1 毒株（A/Puerto Rico/8/1934），两剂三价疫苗免疫小鼠体重减轻中度（15%），仍然也提供了显著的免疫保护作用。在针对H3N2毒株或者乙型流感病毒Victoria毒株的攻击时，两剂三价疫苗免疫小鼠也表现出类似的结果。

用一剂三价 circRNA 疫苗免疫小鼠不仅能触发显著的血清抗体滴度，而且，还可以在 B/Colorado/06/2017 的致命攻击中存活下来。这说明三价 circRNA 疫苗只需注射一次即可有效保护小鼠。

开发广谱流感疫苗仍然是一项重大挑战。目前的疫苗主要针对高度可变的 HA 蛋白，导致对漂移流感病毒株的有效性降低。虽然 NA 表现出的抗原变异比 HA 小，但它天然是一种免疫亚显性抗原。在流感病毒的表面，HA 的含量高于 NA。这意味着免疫系统通常会优先考虑 HA 反应，可能会忽略保守的 NA 表位。由于 NA 的大多数保守 B 细胞表位依赖于天然构象，因此诱导针对这些构象表位的抗体仍然是一个重大挑战。

为了应对这一挑战，本研究通过 circRNA LNP技术递送组合 NA 免疫原以实现广谱免疫保护。三价 circRNA 疫苗有效保护小鼠免受各种 H1N1、H3N2 和 B 流感病毒的侵害。这种保护可能涉及 NAI、Fc 介导的效应功能和 NA 特异性 T 细胞反应的组合。这些发现加强了 circRNA 作为流感疫苗有前途的平台的潜力，并强调了 NA 在开发通用流感疫苗中的重要性。通过这项工作，circRNA 展示出其作为广谱疫苗平台的强大潜力。

[1] Yue X, Zhong C, Cao R, Liu S, Qin Z, Liu L, Zhai Y, Luo W, Lian Y, Zhang M, Lu H, Wang Y, Xu M, Liu S, Lv K, Sun Y, Zhu X, Mai H, Liao J, Yang J, Deng L, Liu Y, Sun C, Zheng KW, Shu Y, Chen YQ. CircRNA based multivalent neuraminidase vaccine induces broad protection against influenza viruses in mice. NPJ Vaccines. 2024 Sep 16;9(1):170. doi: 10.1038/s41541-024-00963-4.

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