近日，西班牙 Certest Biotec S.L公司团队在 bioRxiv 上传预印本文章：A complete approach for circRNA therapeutics from purification to lyophilized delivery using novel ionizable lipids，这项研究主要有以下几个方面的亮点：优化 IVT 反应的时间和镁离子浓度使得 circRNA 产量达到最佳；
在 circRNA 序列中添加 PloyA 尾巴，利用 Oligo dT 纯化 circRNA；
Oligo dT 纯化得到的 circRNA 在细胞水平和体内表达效果均优于kit 试剂盒或者 HPLC 纯化得到的 circRNA；
采用新型可电离脂质递送 circRNA；
冻干工艺不会影响 circRNA LNP 体内表达效果。
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合成 circRNA 的最佳 IVT 反应时间和镁离子浓度
研究人员采用 PIE 环化策略来合成 Fuc-circRNA，希望通过优化 IVT 反应时间和 Mg2+浓度提升 circRNA 产量和纯度。首先，在保持 Mg2+浓度不变的情况下，测定不同 IVT 反应时间的产物中 circRNA 占比。结果发现，IVT 反应时间为 3h 时，circRNA 在 IVT 产物中占比是最高的。接着，将 IVT 反应缓冲液中的 Mg2+浓度对 circRNA 产量的影响。IVT 反应缓冲液中的 Mg2+浓度为 16.5mm 时，产物中 circRNA 比例最高，约为 60%左右。而且，当 IVT 反应缓冲液中的 Mg2+浓度为 5mm 时，IVT 产物中检测不 circRNA 生成。此外，通过 4%聚丙烯酰胺尿素变性胶也证实 IVT 反应缓冲液中的 Mg2+浓度为 16.5mm 时，circRNA 在 IVT 产物中比例最高；毛细管电泳显示，IVT 反应为 3h 或者 Mg2+浓度为 16.5mm 时，circRNA 在 IVT 产物中比例最高。![]()
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Oligo 亲和层析纯化 circRNA
对于 circRNA 常规合成来说，在 IVT 结束后，会添加 GTP 和 Mg2+进行额外的环化反应。接着，用 RNase R 处理纯化到的环化反应产物，去除线性 RNA。最后，再对 RNase R 反应产物进行纯化。为提升 circRNA 产量，研究人员选择绕开 RNase R 和后续纯化步骤，选择在 circRNA 序列设计中添加 PolyA 尾巴，直接采用 Oligo(dT)25 亲和层析纯化环化反应产物。![]()
在环化反应结束后，采用 RNA 纯化试剂盒（kit）回收到的总 RNA 为 55.7ug/ug pDNA，其中，circRNA 占比为 28.4ug/pDNA。形成鲜明对比的是，采用 Oligo(dT)25 亲和层析回收到的总 RNA 量要更少，约为 18.9ug/ug pDNA，但是回收产物中 circRNA 比例更高，约为 13.1ug/ug pDNA。在凝胶电泳图中，可非常清晰地观察到，与 IVT 原液相比，RNA 纯化试剂盒（kit）回收产物中 Intron 和 precursor 的比例只是发生轻微下降，但是，在 Oligo(dT)25 亲和层析产物中已经完全观察不到 Intron 和 precursor 的存在。这也再一次证实采用 Oligo(dT)25 亲和层析回收环化反应产物完全可以替代 RNase 处理纯化法。circRNA/nicked RNA 比值是表征 circRNA 纯度重要的参数。Oligo(dT)25 亲和层析回收产物的 circRNA/nicked RNA 比值是 kit 试剂盒纯化回收产物的 2 倍多。由于 dsRNA 会触发天然免疫反应，因此，mRNA 原液中 dsRNA 的存在不利于其蛋白表达。对于 RNA 疗法来说，一般认为 0.5% dsRNA 基线是可接受的。让人感到惊艳的是，采用 Oligo(dT)25 亲和层析回收到的环化反应产物中 dsRNA 含量低于 0.05%，这要比 kit 试剂盒纯化回收产物中 dsRNA 含量降低 18.8 倍。这说明采用 Oligo(dT)25 亲和层析纯化 circRNA 可完美去除 dsRNA 含量到安全线水平以下。
研究人员将 Oligo(dT)25 亲和层析纯化的 circRNA-Oligo(dT)、kit 试剂盒纯化的 circRNA-kit 以及从 HPLC 纯化的 circRNA-ctrl 按照各 100ng/well/1×10^4^ cells 比例转染 A549/Hela/HEK293T 细胞，转染试剂为 Lipofectamine MessengerMAX^TM^。转染细胞 24h 后，裂解细胞，测定荧光素酶表达水平。在 HeLa 细胞中，circRNA-Oligo(dT)蛋白表达水平要比 circRNA-ctrl 高出 14 倍，要比 circRNA-kit 高出 9 倍，要比甲基假尿嘧啶修饰的线性 mRNA 高出 2 倍。类似的蛋白表达趋势，在 A549 细胞和 HEK293T 细胞也观察到。也就是说经过 HPLC 或者 kit 纯化的 circRNA 其细胞内的蛋白表达水平远达不到修饰线性 mRNA 的，只有 Oligo(dT)亲和层析纯化的 circRNA 细胞蛋白表达水平才好于修饰线性 mRNA 的。![]()
研究人员采用肌肉注射途径将 SM102 LNP 包封的 Fluc circRNA 或者 mRNA 注射进入小鼠体内，在不同时间检测体内荧光信号表达。在将近六天的时间内，Oligo(dT)25 亲和层析纯化的 circRNA-Oligo(dT)体内荧光素酶各时间和总的表达水平要高于线性 mRNA 和 HPLC 纯化的 circRNA-ctrl。让人感到大为诧异的是，对于 HPLC 纯化的 circRNA-ctrl 来说，其体内的蛋白水平也远远不如线性 mRNA。![]()
采用不同的可电离脂质组成的 LNP 包封经 Oligo（dT）纯化到的 circRNA，利用肌肉注射途径将 circRNA-LNP 注入体内。与 SM-102 LNP 包封的线性 mRNA 相比，经 SM-102 LNP 包封的 circRNA 在小鼠体内的荧光素酶表达可持续至第 14 天，而且，其他筛选到的新型可电离脂质包封 circRNA 在小鼠体内的荧光素酶表达水平要优于 SM102，其中，CP-LC-0867 递送 circRNA 在小鼠体内的蛋白表达水平最高。![]()
研究人员采用 CP-LC-0729 LNP 包封经 Oligo（dT）纯化到的 Fluc circRNA，并且制备成 LNP 冻干制剂。与未冻干 LNP 制剂相比，冻干工艺并不会对 circRNA 体内的表达水平造成影响。![]()
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