氨基酸的活化：在氨酰 - tRNA 合成酶、ATP 及二价阳离子（如 Mg²⁺）存在的条件下，氨基酸与 ATP 结合。氨酰 - tRNA 合成酶催化氨基酸的羧基与 ATP 的磷酸基团发生反应，形成氨基酰 - AMP 复合物，并释放出一分子焦磷酸（PPi）。此过程中，氨基酸被活化，为后续与 tRNA 的结合提供了能量和活性形式。
形成氨基酰 - tRNA 合成酶 - 氨基酰 - AMP 复合物：生成的氨基酰 - AMP 仍然紧密地与氨酰 - tRNA 合成酶分子结合，形成氨基酰 - tRNA 合成酶 - 氨基酰 - AMP 三联复合物。
tRNA 的识别与结合：氨酰 - tRNA 合成酶对 tRNA 和氨基酸都具有高度特异性，它能够识别特定的 tRNA 分子。tRNA 分子上有多个区域可被氨酰 - tRNA 合成酶识别，包括接受臂、二氢尿嘧啶茎、反密码子茎和反密码子等，但反密码子并非是所有氨酰 - tRNA 合成酶识别的首要靶点.
氨基酰转移到 tRNA 上：氨酰 - tRNA 合成酶将氨基酰 - AMP 上的氨基酰转移到 tRNA 的氨基酸臂，即 3'- 末端 CCA-OH 上，使氨基酸通过酯键与 tRNA 相连，形成氨基酰 - tRNA 。根据氨酰 - tRNA 合成酶的类型不同，氨基酸可连接到 tRNA 3' 端核糖的 2'-OH 或 3'-OH 上.
