作为继“DNA双螺旋结构”、“基因组技术”之后的第三次生物科技革命，合成生物学在近年发展迅速。高效且准确地筛选优化菌株是合成生物学研发中的关键限速步骤，所以快速、准确、同时定量多种目标代谢物对于多角度菌株性能评估和菌株筛选至关重要。本期内容介绍最新文献报告的一种新的合成生物学研究创新平台——超高通量前处理和分析系统（Ultrahigh throughput pretreatment and analysis，UTPA）[1]，及其在合成生物学高通量筛选中的应用。
如下图1所示，UTPA平台由两个模块组成，自动化的样品预处理系统（模块A）和ADE-OPI-MS系统（模块B）。模块A使用Beckman自动化工作站，包含了耗材堆栈、液体处理工作站、正压过滤模块，低温高速离心机，通过机械臂实现内部串联。模块B使用SCIEX Echo™ MS系统，包含了声波激发进样系统、OPI系统和三重四级杆质谱系统。模块A自动连续整合了培养基分离、样品稀释、转移、离心和涡旋五个步骤，在处理384孔样品板时，需要的时间小于20 min。模块B单个样品的进样分析仅需1到3s，对于384孔样品完成分析仅需6.4到19.2 min[1]。
这一开创性的平台实现了工业菌株筛选中高速代谢物预处理和分析，每个样品的速度达到了前所未有的秒级，它提供了高精密度和高准确度，显著提高了筛选过程的效率。接下来分享两篇采用UTPA技术进行合成生物学研究的应用实例。
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图1. 超高通量前处理及分析平台（UTPA）
实例一：通过Echo MS实现自动化和
集成化超高通量工业菌株筛选
文献报道了科学家开发了一种创新的平台，即超高通量预处理和分析（UTPA）系统，通过集成专用自动化设备和Echo MS技术实现了无缝联机集成和菌株筛选的高度自动化。整个分析过程可实现从培养基分离预处理到Echo MS上样分析的全流程自动化。整个分析过程完全由机械臂自动化完成，无需人工干预。与手动处理相比，UTPA平台显著缩短了时间和成本，最大通量约为每天17000到28000个样品。
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图2. 使用UTPA平台筛选谷氨酸高产菌株。348个测试菌株（黑色柱）和12个对照菌株（红色柱）接种到四个96孔板进行亚培养。在每个轨道中，测试样品按分析物含量的水平排列，并使用百分比进行快速观察阳性率。中央的Venn图显示使用不同标准筛选出的阳性菌株的交集。
研究者通过在六种发酵培养基中筛选谷氨酸高产菌株展示了UTPA平台的快速菌株筛选能力。通过定量四种代表性代谢物（谷氨酸作为目标产物，谷氨酰胺作为潜在干扰和副产物，乳酸作为主要副产物，葡萄糖作为发酵底物），从多个层面评估了菌株的性能，成功从348个测试菌株中筛选到高产谷氨酸的候选菌株9株。
多指标筛选的使用显著降低了阳性率，从单一指标的52个菌株（阳性率14.9%）降到多指标的9个菌株（阳性率2.6%），该方法可减少进一步使用更大规模的生物反应器验证所需的工作量和时间，提高了菌株筛选效率。
UTPA平台在40分钟内快速筛选了348个测试菌株，展示了卓越的效率。与传统的LC-MS方法相比，加速了筛选过程72倍 [1] 。
实例二：采用Echo MS对寡核苷酸
进行高通量筛选分析
寡核苷酸是生物研究的基础，在合成生物学领域，高通量寡核苷酸测定是必不可少的，对于确保DNA合成质量至关重要 [2]。SCIEX Echo MS 技术通过使用声波能量以无接触的方式迅速将样品引入质谱，取代了液相分离的同时又可防止样本残留。单个样品的分析时间范围为1到3秒，最小样品体积为2.5 nL，大大减少了样品浪费（图3）。与MALDI-MS相比，它的数据重现性也更好 [2] 。
文献报道了对TdT突变体（ZaTdT-R335LK337G）的催化活性进行了深入的分析，同时建立了一种高通量的Echo MS分析方法用于筛选TdT突变库。作者根据反应轮廓优化了基于Echo MS的高通量质谱筛选方法，该方法可以有效区分单个碱基的插入效率。经过两轮筛选后，突变体ZaTdT-R335L-A193T-G337H-H478G的催化活性比阳性对照高出约2.5-4倍。这一进展在从头合成基因的新兴领域中具有特殊意义。
在进行寡核苷酸分析时，Echo MS技术与PAGE（ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ）方法相比效率提高了60倍，而与LC-MS相比则提高了200倍的分析效率 [2] 。结果表明Echo MS分析技术在DNA编码库筛选、寡核苷酸类疫苗研究、基因合成等多个领域具有巨大应用前景，可以不久的将来促进医学和生物科学的加速发展。
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图3. TdT突变体的高通量筛选。(a) TdT的高通量筛选工作流程。(b) TdT的高通量筛选位点区域和高通量质谱分析结果中CCA-ONH2峰面积与CC峰面积的比值。
SCIEX Echo MS系统
在合成生物学分析中的优势总结
更快的分析速度
1秒/样品的速度分析样品，真正实现超高通量分析。
更低的样品消耗量
进样体积仅2.5 nL，减少样本的浪费。
更简便的样本制备
一般情况下，发酵液可简单稀释后直接分析。
更简单的方法开发流程
无需优化分离方法，如寡核苷酸分析时无需添加离子对试剂。
更低的成本消耗
无色谱柱分离，减少耗材成本的消耗。
无残留及干扰
非接触式的进样方式在快速分析样品的同时确保无交叉残留影响。
参考文献
[1] Automated and Integrated Ultrahigh Throughput Screening for Industrial Strain Enabled by Acoustic-Droplet-Ejection Mass Spectrometry. Zhidan Zhang, Chao Zhang, Xu Zhang, et al. Journal of Pharmaceutical Analysis 14 (2024): 100949.
[2] High-Throughput Screening for Oligonucleotide Detection by ADE-OPI-MS. Lingling Hu, Zhidan Zhang, et al. Analytical Chemistry. 96 (2024):12040.
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