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大家好，我们又见面了。上期内容， 我们了解了EAD （Electron activated dissociation，电子活化解离）在生物药深度表征中的应用，主要解决了氨基酸异构体区分，二硫键位点和翻译后修饰等难点。本期内容，我们将介绍EAD在抗体De Novo测序、肽图二级覆盖率和Middle-Down生物药表征3个应用场景下的应用，方便大家更好地理解EAD技术。
本期内容
抗体从头测序在生物制药行业中是复原抗体序列的重要手段。蛋白从头测序技术（De Novo Sequencing）是利用串联质谱获取碎片离子，根据两个片段离子之间的质量差来计算肽链上氨基酸残基的质量，从而得到蛋白的氨基酸序列的分析过程。
该技术最大的优点在于不需要依赖任何数据库，就可对已知蛋白或未知蛋白进行序列分析。分析过程，需要样品进行多酶解实验，将酶解后的肽段进行质谱检测，数据采集后的质谱图用de novo算法进行解析并获得对应的肽段序列，经过肽段间的比对拼接，从蛋白N端到C端拼装出来，得到蛋白的氨基酸序列。对于质量数相近或相同的氨基酸异构体，如亮氨酸vs.异亮氨酸，是蛋白从头测序技术的难点之一，因为传统的CID碎裂技术很难解决这个问题，而EAD碎裂技术正好可以解决这个难题。
以曲妥珠单抗样品进行从头测序为例，EAD模式可以很好地区分亮氨酸及异亮氨酸1。亮氨酸在EAD模式下可产生z-43的特征性离子，异亮氨酸产生z-29的特征性离子，根据特征性离子的不同可对二者进行区分，图1中展示了在EAD碎裂模式下，含有亮氨酸的序列产生z-43碎片离子，且该肽段中包含三个亮氨酸，均由z-43碎片而加以确定。
图1. 包含多个亮氨酸特征碎片z-43的肽段EAD MS/MS谱图1
肽图分析是生物药表征常用手段。但使用CID（Collision-induced dissociation，碰撞诱导裂解）技术在进行较长多肽碎裂时效率较低，不易获取较高的二级序列子离子覆盖度。选用EAD技术进行较长多肽碎裂往往会收到意想不到的效果，相较CID碎裂，可获得更高的二级序列覆盖度。
采用IgG单抗，经胰蛋白酶酶解后样本，比较了CID及EAD两种碎裂方式对长度较长多肽的碎裂情况，结果显示采用EAD碎裂能获得更全面的二级子离子覆盖信息。结果如图2所示：
图2. 与CID MS/MS比较，EAD MS/MS谱图提供更高的二级覆盖度
Middle-down工作流程是一种新型的抗体药表征方法，相比于Top-down分析，该流程降低了蛋白的复杂性，碎裂效率明显提升，碎片离子更为丰富；相比于Bottom-up分析，该流程样品制备更加简单，人为干扰因素少，数据处理更简单，分析通量更高。Middle-down工作流程中，传统的CID技术在长序列的中间部分覆盖率较低，EAD技术分析二硫键链接的蛋白亚基可以很好的弥补这一问题，并获得高质量精度、高序列覆盖率的碎片信息，可以很好的应用于蛋白序列的快速确认以及蛋白翻译后修饰（PTMs）位点的精确定位。
使用贝伐珠单抗样本经Ides蛋白酶酶解得到不同的蛋白亚基，进行Middle-down工作流程单抗表征2。使用EAD碎裂模式可以有效促进二硫键连接的蛋白序列的碎裂，实现序列的高覆盖率分析。如图3所示，综合EAD对完全还原的蛋白亚基以及二硫键连接的蛋白亚基两针EAD分析结果，可以提供大约91%的蛋白亚基序列覆盖率。
图3. Middle-down工作流程对贝伐珠单抗中二硫键连接的轻链序列覆盖率以及结合完全还原的蛋白亚基的2针EAD分析综合序列覆盖率分析谱图
本期内容介绍了EAD在抗体De Novo测序、肽图二级覆盖率和Middle-Down生物药表征3个应用场景下的优势。最后，让我们来总结一下本期内容：
1
EAD能更好地解决氨基酸异构体，如：亮氨酸和异亮氨酸，鉴定难题；在抗体De Novo测序中尤为重要；
2
EAD能提高较长多肽碎裂的二级序列覆盖率，做到准确鉴定；
3
在Middle-down工作流程中，EAD能有效碎裂二硫键连接的蛋白序列，从而大大提高了蛋白亚基序列覆盖率。
本系列内容“细节控，看EAD生物药深度表征”，到这里就结束了。希望大家对EAD在生物药深度表征有了一定的了解。下期内容，我们将介绍EAD技术在蛋白组学中的应用，欢迎大家的关注。
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EAD (Electron activated dissociation)
电子活化解离应用案例
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