前言
蛋白质组学作为研究生物系统中蛋白质的组成、结构和功能的学科，对于揭示生命的奥秘和疾病的机制具有重要意义。随着蛋白质组学技术的发展，DIA数据非依赖采集技术已成为研究大样本量以及复杂体系蛋白质样品的首选技术，该技术摆脱了传统的DDA数据依赖性采集技术偏向性采集和仅碎裂高丰度肽段的缺点，可以无遗漏地采集样本中所有离子的全部碎片信息，包括低丰度的肽段离子，大大减少了数据缺失值，提高了数据的利用度。
先前已有研究表明，使用ZenoTOF® 7600系统，结合Zeno SWATH DIA采集模式，可以从细胞裂解液中鉴定和定量蛋白质。
在对来自不同细胞状态或患者的样品之间的蛋白质进行鉴定和相对定量后，作为验证过程的一部分，通常会在大样本量的样品组中对蛋白质进一步定量鉴定，进而寻找和发现有价值的生物标志物。
本次实验结果显示使用ZenoTOF 7600系统的MRMᴴᴿ和Zeno SWATH DIA采集模式对复杂基质中的多肽进行定量分析，在K562细胞裂解液中，酵母醇脱氢酶1 (ADH1)的定量下限为0.02 fmol/µL。同时MRMᴴᴿ和Zeno SWATH DIA方法均具有良好的线性关系，线性动态范围分别为3.0和2.5个数量级。这些结果凸显了ZenoTOF 7600系统优异的定量能力，使其成为蛋白质生物标志物鉴定和定量验证的理想工具。
使用ZenoTOF 7600系统
进行蛋白质组学定量的主要特点
1. 在ZenoTOF 7600系统上，使用Zeno SWATH DIA可以实现蛋白组层面的定量分析，即可以同时定量生命体内表达的可检测到的每个蛋白；
2. 在ZenoTOF 7600系统上，使用Zeno SWATH DIA或MRMᴴᴿ方法进行基质样品中蛋白定量分析，定量下限低至0.02 fmol/µL，同时两种采集方式均显示出良好的定量线性动态范围；
3. 采用MS/MS累积时间为40 ms的MRMᴴᴿ方法，其灵敏度比采用MS/MS累积时间为13 ms的Zeno SWATH DIA方法平均提高了约3倍；
4. sMRMᴴᴿ和Zeno SWATH DIA方法具有很强的稳定性，在连续45次进样中，峰面积相对标准偏差分别为5.52%和6.13%。
方法
样品制备：
人K562胰蛋白酶解产物购自Promega，PepCalMix肽标准品终浓度为1 fmol/μL。在加入1 fmol/µL PepCalMix的K562稀释液中，制备烯醇化酶1 (ENO1)、兔磷酸化酶b (PYGM)、酵母醇脱氢酶1(ADH1)和牛血清白蛋白(ALBU) 4种蛋白混合物的标准曲线，其中ADH1标准曲线的浓度范围为0.02-20 fmol/µL。
液相色谱和质谱：
Waters M-Class液相色谱。直接进样方式，进样体积5µL。ZenoTOF 7600系统搭配OptiFlow Turbo V离子源；源参数设置：离子喷雾电压4500 V，源气温度225℃，气帘气35 psi，gas1 20 psi，gas2 60 psi；数据使用SCIEX OS软件的Analytics模块处理。
实验结果
1. ZenoTOF 7600系统具有优异的稳定性
利用基质样本添加的PepCalMix标准肽对ZenoTOF™ 7600系统的MRMᴴᴿ和Zeno SWATH DIA方法进行稳定性考察，图1显示了肽段AGLIVAEGVTK+2y7在连续进样45次后的峰面积重现性。两种方法的峰面积的相对标准偏差（RSD）均小于10%，sMRMᴴᴿ方法的相对标准偏差为5.52%，Zeno SWATH DIA方法的相对标准偏差为6.13%。
图1. 肽段AGLIVAEGVTK+2y7的峰面积重现性
2. ZenoTOF 7600系统具有高检测灵敏度
在ZenoTOF 7600系统上，对MRMᴴᴿ和Zeno SWATH DIA方法进行灵敏度考察。图2显示了使用Zeno SWATH DIA与sMRMᴴᴿ方法对ENO1（烯醇化酶1）中肽段AVDDFLISLDGTANK定量的比较结果。对15个的肽段定量信噪比进行比较，结果显示，与Zeno SWATH DIA方法相比，使用sMRMᴴᴿ方法的信噪比平均提高了3倍。
图2. ENO1中肽AVDDFLISLDGTANK的S/N比较
3. MRMᴴᴿ和Zeno SWATH DIA方法均具有良好的线性和准确度
在ZenoTOF 7600系统上，通过Zeno SWATH DIA和sMRMᴴᴿ两种方法确定ADH1中肽段ANELLINVK的定量下限 (LLOQ)和线性动态范围，表1显示了K562细胞裂解液中ADH1在0.02到20 fmol/µL的标准曲线上的准确度和精密度。采用sMRMᴴᴿ方法，最低检出限为0.02 fmol/µL，线性动态范围为3个数量级；采用Zeno SWATH DIA方法，最低检出限为0.06 fmol/µL，线性动态范围为2.5个数量级，两种方法均展现出良好的线性、精密度和准确度。
表1. ADH1中肽段ANELLINVK的精密度和准确度
总结
MRMᴴᴿ和Zeno SWATH DIA方法均具有良好的线性和准确度，且对于MRMᴴᴿ方法，肽段的定量下限为0.02 fmol/µL。
采用MS/MS累积时间为40 ms的MRMᴴᴿ方法，其灵敏度比采用MS/MS累积时间为13 ms的Zeno SWATH DIA方法高约3倍。
MRMᴴᴿ和Zeno SWATH DIA模式都能在较短的梯度下，实现数千条肽段的定量分析。
ZenoTOF 7600具有优异的定量能力，是蛋白质生物标志物鉴定和定量验证的理想选择。
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扩展阅读
1. A flexible microflow set-up for the identification and quantitation of proteins in complex samples using Zeno SWATH data-independent acquisition (DIA). SCIEX technical note, MKT-28588-A
2. 用 Zeno MS/MS技术 对 804 种多肽进行高重现性大规模、靶向定量分析. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-13346-ZH-A.
3. Quantifying 1000 protein groups per minute of microflow gradient using Zeno SWATH DIA on the ZenoTOF 7600 system. SCIEX technical note, RUO-MKT-02-15429-A.
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