前言
小核酸药物行业发展迅速，至今已有15款药物获批，成为继小分子和抗体药物后的第三波创新药浪潮。然而受限于递送手段的限制，目前已上市的小核酸药物仅能针对肝脏靶点。小核酸抗体偶联药物（Antibody-oligonucleotide conjugates，AOC）利用抗体将治疗性寡核苷酸递送至特定细胞或组织，将抗体的组织特异性优势，与小核酸的靶点特异性优势相结合，拓展了寡核苷酸药物的组织/细胞靶向性。近年来，诸多公司将注意力和资源集中在开发基于AOC技术的先进药物上，2021年11月，AOC先驱Avidity Biosciences公司的小核酸抗体偶联物AOC1001的I期临床试验完成首例患者给药，标志着全球首款AOC药物进入临床试验。
AOC药物作为具有巨大潜力的新型生物药物，其药物质量的控制对于安全性和有效性至关重要。一方面，每个部分包括抗体的纯度、特异性、亲和力等，小核酸的纯度、稳定性，连接子的稳定性、细胞毒性等需要检测；另一方面，完整AOC药物本身的质量包括抗体和小核酸的偶联比例、游离抗体、游离小核酸的比例等都需要严格监测。
图1. AOC药物的示意图
材料和方法
样品
本实验使用的样品为一种单抗偶联寡核苷酸的AOC药物，浓度为40 mg/mL。IgG的理论分子量为147244 Da，寡核苷酸(oligodeoxynucleotide, ODN)的理论分子量为6581Da，与IgG连接前需先对ODN进行修饰，将ODN的5`-端磷酸骨架与HS-C6结构反应，形成HS-C6修饰的ODN(分子量6777Da)。
IgG和ODN的连接方式为Sulfo-SMCC偶联方式，偶联过程见图2，整个偶联过程分为两步，第一步IgG的游离-NH2与SMCC反应形成马来酰亚胺激活抗体(maleimide-activated IgG)，之后再与连接在HS-C6的ODN反应，得到最终的偶联产物。
结果与讨论
1. CZE结果分析
在CZE条件下可有效分离游离IgG，AOC及游离ODN分子。标准品和样品的分离结果见图3。
在CZE中，样品的分离基于分子在电场作用下荷质比的差异。在碱性缓冲液条件下，由于样品中的IgG、ODN以及AOC都带负电荷，在正电场下荷质比越大的分子迁移速度越慢。荷质比主要由电荷数和分子量决定，游离IgG分子量最大，带的负电荷数量比较少，荷质比小，因此会最先出峰。游离ODN由于分子量最小，电荷数最高，因此荷质比最大，会最后出峰。对于AOC来说，其分子量与IgG相比变化不大，而电荷数随着ODN的偶联而增大，因此迁移速度会慢于IgG，且偶联的OND数目越多，电荷增加越多，迁移速度越慢。迁移时间顺序为，IgG < IgG-(n)ODN<odn< span="">。在本次实验中，IgG标准品的迁移时间在6.25 min，ODN标准品的迁移时间在20.95 min，与上述理论推导出峰顺序一致。
AOC样品各峰指认：峰1迁移时间与IgG标准品的一致，推测为游离IgG的峰。峰2,3,4迁移时间6.97-8.52 min，在IgG和ODN之间，根据前述理论推导，推测为IgG上偶联了不同数量ODN分子的峰，且峰2偶联的ODN分子数量最少，峰4偶联的ODN分子数量最多。峰7迁移时间与ODN标准品的一致，推测为游离ODN的峰。峰5和峰6迁移时间比峰7略早，但是紫外吸收光谱图与ODN标准品的一致，推测分别为HS-C6修饰的ODN及其二聚体。
图3. CZE条件下空白对照、AOC样品，IgG标准品及ODN标准品的电泳图。
2. LC-MS结果分析
为了验证CZE中推断的峰2、3、4是否为IgG偶联了不同数量ODN的峰，并确认偶联的数量，我们尝试了HRMS的方法。通过HRMS分别检测了IgG标准品和AOC样品， MS结果见图4。在SCIEX OS软件中对IgG标准品TOF MS图谱进行解卷积，确认IgG的分子量为147244.2Da，在AOC样品TOF MS图谱的解卷积结果中也检测到分子量为147246.3Da的一簇峰，推断是游离IgG的峰，与IgG标准品相比多的2Da可能是由于AOC样品异质性较强导致的解卷积后分子量差异。在AOC解卷积图谱中还检测到比游离IgG分子量多6994.6Da, 13987.8Da以及20847.4Da的峰，鉴定为IgG连接1个ODN(IgG-1ODN)，2个ODN(IgG-2ODN)和3个ODN(IgG-3ODN)的峰。增加的6994.6Da为IgG上连接了SMCC linker及HS-C6修饰的ODN分子产生的分子量。
HRMS的结果验证了CZE中峰2，峰3和峰4确实是IgG偶联了不同数量寡核苷酸，而且确认峰2,3,4分别为IgG-1ODN，IgG-2ODN和IgG-3ODN。
在游离IgG的峰簇中还看到分子量加221.8Da的异构体峰，为IgG连上了一个linker，与图2中的AOC偶联过程相符合，偶联物从图2虚线处断开即为IgG加221Da的分子量。
图4. IgG标准品和AOC样品的HRMS图谱。A.总离子流图(TIC图，蓝色为IgG标准品的，红色为AOC样品的)。B. TOF MS图(蓝色为IgG标准品的，红色为AOC样品的)。C. IgG标准品的解卷积结果。D. AOC样品的解卷积结果。
进一步将原始数据上传至SCIEX Biologics Explorer软件进行完整分子量分析，计算IgG，IgG-1ODN，IgG-2ODN及IgG-3ODN各峰的峰面积见图5(Volume)，通过峰面积计算各峰的比例分别为32.90%，44.54%，20.52%及2.03%。
CZE与HRMS两种结果计算的各组分比例比较如表2。从表2可以看出，CZE和HRMS两种技术计算的不同组分的比例比较一致。
表1：AOC药物中各组分比例
*注：CZE条件也可以分离检测到游离ODN及ODN与连接肽相连的峰，因为HRMS条件下无法检测到游离的ODN，因此，在与HRMS计算的组分对比时CZE也没有考虑ODN的比例
结论
利用PA800 Plus，采用CZE方法有效分离了AOC药物中的游离IgG，不同ODN偶联数量的AOC以及游离ODN等不同形态的分子，实现AOC药物与游离杂质之间的分离。
利用X500B高分辨质谱，进一步验证了CZE分离得到3个IgG-ODN偶联物相关的峰分别是IgG-1ODN，IgG-2ODN和IgG-3ODN。
CZE和LC-MS两种方法计算的各组分比例高度一致，说明两种方法在对AOC药物进行组分分离和结构确认时可以相互佐证，得到更为准确可信的结果。
参考文献
1. Lin Shen, et al. Chemical Biology Approaches toward Precise Structure Control of IgG-Based Antibody-Oligonucleotide Conjugates. Chembiochem.2023 May 2;24(9)
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