背景
靶向降解技术（Target protein degradation，TPD）是药物设计领域的重要新兴技术。典型的小分子降解剂PROTAC由靶向目标蛋白的配体，靶向E3连接酶的配体和连接链三部分组成。不同的E3连接酶可能具有不同的组织分布和底物偏好，因此E3连接酶配体的选择直接影响到靶向降解的效率。尽管目前在人体内已经鉴定到600多种E3连接酶，只有CRBN，VHL等少数几个E3酶在TPD实践中得到了应用。因此，通过开发能够高效招募其他E3连接酶的小分子配体来探索更多有应用潜力的E3连接酶也是TPD领域的重要发展方向。
E3连接酶适配体KLHDC2/3/10属于CRL家族，能够识别蛋白的C端降解子，并高效介导C端末端序列为甘氨酸-甘氨酸的蛋白的降解。在这三者之中，KLHDC2的kelch结构域与底物小肽SelK的高分辨共晶结构已经得到解析（PDB id: 6DO3）。这两点使得KLHDC2具有发展为TPD可用的E3酶的潜力。来自Arvinas公司的科学家近期在Nature Structure & Molecule Biology上报道了基于CADD的KLHDC2小分子配体设计，并验证了该配体在PROTAC上的可行性。除此以外，作者发现KLHDC2在催化过程中存在四聚复合物-单体的聚集状态变化，并且该过程可以被底物或小分子所调控，为该酶的机制提供了新的见解。
1. KLHDC2小分子配体的发现
作者从kelch结构域与底物SelK的共晶结构出发，利用从头生成技术设计潜在的小分子配体，并通过对接、模拟、实验等方法进行了多轮的优化，最终得到了有较好潜力的KLHDC2配体化合物。文章中没有详细地介绍每一轮生成的化合物以及优化的策略和结果，只是简要描述了分子设计的过程，如图1a所示。首先，为保证小分子的亲和力与特异性，作者保留了GG降解子的远端甘氨酸结构，近端的甘氨酸则被替换为吡啶酮。这一结构在结合过程中提供氢键以及阳离子-相互作用。进一步的配体生成则引入萘啶酮结构以形成更多的氢键并强化阳离子-相互作用。萘啶酮上的丁基取代基则用于模拟天然底物小肽中的脯氨酸，结合到口袋的疏水部分中。最后一步在萘啶酮上引入了氨基甲酸酯的linker结构，这一结构指向天然底物中最终被泛素化的位置的方向，确保形成三元复合物时靶蛋白能够有效地被泛素化。最终得到的配体结构如图1b，KDRLKZ-1/2化合物的唯一区别在于萘啶酮杂环上取代的丁基结构不同，一个是异丁基，一个是仲丁基。其结合实验的结果列于图1c-f。SPR等实验证明了配体与KLHDC2具有高亲和力，alphaLISA和TR-FRET实验则说明了化合物与KLHDC2底物具有竞争能力，验证了其结合位点。值得注意的是，从构效关系上看，化合物吡啶酮基团上取代的羧基对化合物的结合具有至关重要的影响。作者基于计算结果分析认为，KLHDC2识别的降解子位于蛋白C端，多肽C端的羧基能够与口袋形成丰富的氢键和盐桥相互作用。共晶的结构解析（图1g-i）证实了KDRLKZ-1的结合模式，各个官能团参与的相互作用都与CADD设计时的预测符合较好。为具体验证化合物对KLHDC2酶活的影响，作者在昆虫细胞中共表达了KLHDC2以及其结合的scaffold蛋白EloB和EloC，纯化了这一三元复合物并在体外验证了KDRLKZ-1对E3介导的泛素化过程的抑制作用。
图1. KLHDC2配体的设计及表征。
2. 基于KDRLKZ的PROTAC可行性验证
作者构建了Biotin-KDRLKZ的二价分子，并利用该化合物成功地从细胞裂解液中pulldown了KLDHC2蛋白。受此启发，作者认为KDRLKZ系列配体具有比较好的PROTAC开发潜力。接下来作者通过两个PROTAC模式体系，来验证了KDRLKZ小分子用做PROTAC开发工具的可行性。首先作者构建了KLHDC2-BRD4 PROTAC分子（配体是JQ1，图2a），并用SPR实验来表征化合物介导KLHDC2-PROTAC-BRD4三元复合物形成的能力。各种PROTAC都表现出了介导复合物形成的能力，三元复合物形成的Kd在几十到几百个纳摩尔之间不等。化合物介导三元复合物形成的能力强弱与PROTAC分子中的连接区域结构有关。较长的，结构较为刚性的连接链对PROTAC的降解活性是比较有利的。进一步地，作者利用HiBiT tag对细胞内的BRD4表达水平进行定量，来评估PROTAC分子的活性。考虑到含有游离羧基的化合物往往透膜能力较差，作者设计了甲酯的前药形式。结果显示，基于KDRLKZ系列化合物的PROTAC能时间依赖地降解细胞内的BRD4，且降解的效果与招募CRBN的PROTAC分子ARV-825接近（图2b, c）。甲酯修饰，且具有联苯形式连接的PROTAC效率最高，能够在4-6 h内将BRD4含量降低约93%（图2d），羧基直接游离的PRTOAC分子相比来说降解活性就稍稍降低了；而酰胺形式的化合物则只能表现出微弱的活性。NAE抑制剂MLN4924或者蛋白酶体抑制剂MG-132的处理能够减少化合物的降解，证明这一降解作用是依赖于泛素化-蛋白酶体通路的（图2e），siRNA敲低实验则证明BRD4的降解是基于KLHDC2实现的（图2f）。
底物特异性方面，作者观察到该系列化合物同样能介导KLHDC2依赖的BRD2和BRD3的降解（图2g）。由于先前已经报道的CRBN或者VHL弹头的相应PROTAC亦表现出对BRD2/3的脱靶现象，作者认为这一结果并不意外。
作者还设计了靶向雄激素受体（androgen receptor，AR）的PROTAC，KDRLKZ系列配体同样表现出了高活性，在12h水平下对AR的降解能力几乎与同浓度的VHL-PROTAC相当（图2h-i）。
图2. 基于KDRLKZ系列小分子的PROTAC设计。
3. 底物调控KLHDC2-EloB-EloC复合物多聚体的形成
在文章的第二部分，作者从蛋白表达纯化时观察到的反常现象出发，对KLHDC2的结构生物学进行了新的探索。如前所述，全长KLHDC2无法单独发挥生物学功能，必须先与EloB和EloC蛋白组装成KBC复合物。这三个蛋白在Sf21细胞系中可以实现共表达并自动组装成复合物，同步地从分子筛上纯化出来。分子筛上KBC的保留时间对应的分子量明显大于其单体的分子量，说明纯化出来的KBC复合物在体外以多聚体的形式存在。MADLI质谱实验证实从单体到四聚体的聚集状态在混合物中同时存在。酶的同源寡聚现象在自然界中是很常见的，也是调控蛋白活性、稳定性等的重要手段。然而，倘若将KBC复合物与底物小肽孵育，则其在分子筛上的保留时间则明显变大，对应的分子量则符合KBC单体。分析性超速离心（AUC）实验亦证实了这一结论（图3b），并且这一现象具有明显的浓度依赖（图3a）。这一结果说明SelK小肽结合到底物口袋的过程会影响到KBC复合物的形成，因此作者首先猜想KBC复合物的形成中，底物口袋应该是被KBC本身的某一段序列占据，而底物小肽与该序列竞争地结合KLHDC2的底物口袋。KLHDC2 C端蛋白质序列为NNTSGS，而SelK小肽结合在口袋中的序列为PPPMAGG，作者观察到这两条序列在结构上具有一定的相似性，尤其是与degron识别紧密相关的C端最末尾几个氨基酸（SGS与AGG）。自然地，他们推测KLHDC2的C端小肽能够结合到其底物口袋内，并通过alphaLISA实验证实了这一猜想（图3c）。相对于底物小肽纳摩尔级的活性，KLHDC2本身C端序列的结合能力在微摩尔级别，证实了为何底物能够高效地将KLHDC2的C端序列竞争掉（图3d）。SEC实验的结果亦证实了这一结论（图3e）。
接下来，作者们尝试通过结构生物学的方法进一步地说明这一现象在分子水平的机制，以期建立“聚集状态-活性”的调控模型。首先作者解析了KLHDC2 klech结构域与NNTSGS小肽的共晶结构，如图3f。该结构与之前解析的klech结构与和SelK小肽的共晶结构高度相似，不过为避免与末端丝氨酸发生碰撞，klech结构与的W270残基位置发生了一定的偏移。这一偏移可能在能量上是不利的。此外，NNTSGS小肽与口袋内的疏水区域的结合也较微弱。这两者可能是NNTSGS小肽的结合较为微弱的原因。
图3. KHLDC2 C端序列介导KBC复合物在体外的动态聚集体组装。
4. 冷冻电镜分析KBC四聚体的结构
为了进一步地阐释KBC四聚体的结构，作者用冷冻电镜对预先交联过的KBC复合物进行结构解析。交联后的KBC复合物呈现比较清晰的单一条带（图4A）。冷冻电镜的图像采集和数据处理如图4B所示。单颗粒分析表明该复合物中占据多数的组分是KBC四聚体，此外还有少量的二聚体或者三聚体。一部分电子密度较好的单颗粒呈现出C2对称性，因此作者在后续处理数据时将这一信息纳入考量。最终得到的结构分辨率为3.8 ，不同区域的局部分辨率如图4C所示，四聚体中间的KLHDC2分辨率相对较好，而外围的EloBC复合体分辨率则相对差一些。
图4. 冷冻电镜分析KBC四聚体结构的工作流程。
最终取得的KBC复合物结构如图5a所示。KBC四聚体在某种程度上可以看作是KBC二聚体的“二聚体”。作者以此结构为基础分析了KLHDC2的C端序列是如何介导四聚体组装的。为方便说明，将一个KBC二聚体内部的两个KLHDC2分别命名为KLHDC21和KLHDC22，另一个二聚体中对应的两个则命名为KLHDC21’和KLHDC22’；氨基酸单字母缩写的注释则说明该氨基酸是来自于哪个KLHDC2蛋白。首先来看KBC二聚体内部的相互作用。与前述共晶结构一致，KLHDC21的C末端结合到了KLHDC22的底物口袋内，如图5b。此外，KLHDC21的BC box和Cullin box也与KLHDC22形成相互作用，包括K3761与N1842形成的氢键和F3751与L582的疏水相互作用，可以参考图5b的小图部分。尽管从位置和取向上看，KLHDC21的N端与KLHDC22之间亦可能存在相互作用，该区域较差的分辨率不允许对其中存在的相互作用进行进一步的分析。KBC二聚体之间的相互作用呈现“循环组装”的模式，也就是说KLHDC22的C端并非结合到KLHDC21的底物口袋，而是插入了KLHDC21’的底物口袋，并依此类推。另外，klech结构与也参与了互作界面的形成，其中主要介导相互作用的是KLHDC21’的179-183号残基和KLHDC22的74-77号残基，如图5c。
5. KBC-E3复合物的聚集状态-酶活调控模型
如前所述，结构分析表明KBC复合物的形成比较依赖于KLHDC2 C端和相邻蛋白底物口袋的循环组装模式，低亲和力的KLHDC2 C端序列可以被具有较高亲和力的SelK小肽从KLHDC2的底物口袋被竞争掉。为了进一步验证这一模型，作者使用SEC测试了KDRLKZ小分子能否发挥类似的竞争作用，并且发现KDRLKZ小分子引起KBC复合物保留时间变大的能力与小分子和蛋白的亲和力呈正相关，如图5d。总结来说，作者提出了如图5e所示的酶活调控模型。当没有底物或者小分子配体存在时，KBC依靠KLHDC2的C端序列组装成复合物，此时KBC复合物没有活性；当SelK小肽或者小分子配体存在时，由于其与底物口袋的亲和力更强，原先四聚体复合物自然破碎为具有活性的二聚体或者单体，并与CRL2催化亚基结合，以介导靶蛋白的泛素化。因此从某种程度上来说，KDRLKZ小分子不仅起到将靶蛋白拉近E3连接酶以实现其泛素化，更发挥了KBC复合物的激活剂的功能。
图5. KBC四聚体内部的相互作用分析及酶活调控模型。
参考文献：
Hickey, C. M., Digianantonio, K. M., Zimmermann, K., and et al. Co-opting the E3 ligase KLHDC2 for targeted protein degradation by small molecules. Nat Struct Mol Biol, 2024, 31, 311-322. doi: 10.1038/s41594-023-01146-w.
