如今，在药物化学领域，降解具有配体的E3连接酶已不再困难。只需将该E3的配体与任意E3配体（包括自身）结合，形成PROTAC，即可实现该E3的降解。
——研究1——
X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）是一种凋亡抑制因子和E3泛素连接酶。XIAP基因在大多数肿瘤细胞株中过表达，与肿瘤的进展、复发、预后以及化疗耐药密切相关。
2021年，Genentech的科学家在开发新型XIAP降解剂时提出一个设想：在XIAP配体上引入一个带末端氨基的尾巴，用以模拟赖氨酸。这个氨基可能被邻近的E2识别并泛素化，导致XIAP的降解（图1）1。
图1. 小分子配体末端氨基模拟赖氨酸
Genentech的科学家合成了一系列带末端氨基的XIAP抑制剂衍生物，并将XIAP抑制剂二聚体作为阳性对照（图2）。
图2. 化合物结构
结果显示，带末端氨基的XIAP抑制剂衍生物确实能降解XIAP，尤其是化合物10，其Dmax达到98%（图3）。
图3. XIAP抑制剂衍生物降解XIAP
随后，研究人员进行了一系列验证，表明化合物10通过泛素-蛋白酶体途径诱导XIAP降解。为验证设想，他们在体外构建了一套人工泛素系统，包含UBE1 (E1)、UbcH5a (E2)、XIAP (E3)、ATP、泛素或甲基化泛素（Me-Ub）。通过SDS-PAGE和LC-MS证明化合物10在体外可被泛素化（图4）。
图4. 左图：在XIAP存在下，带荧光基团的化合物10-TAMRA被多泛素化或单泛素化；右图：在XIAP存在下，生成10-Me-Ub
作者将他们的技术称为K-tag。
图5. K-Tag示意图
——研究2——
2023年，另一项类似研究在BioRxiv上出现，主要探讨NSD2抑制剂如何转变为降解剂，并于2024年正式发表2。
NSD蛋白家族（nuclear receptor binding SET domain proteins）包含NSD1、NSD2和NSD3，与肿瘤发生相关，是组蛋白甲基化转移酶，对染色质稳定和基因表达调控至关重要。作者前期研究发现UNC8153可引起NSD2蛋白降解（图6）。基于此，作者合成了一批类似物进行构效关系研究，发现UNC8732分子活性最佳，Dmax为97%。
图6 .化合物结构及活性
UNC8732不仅能诱导细胞内野生型NSD2蛋白降解，还可诱导致病型NSD2 E1099K降解（图7）。
图7 . UNC8732诱导NSD2降解
与前一研究不同，作者认为化合物Linker的一级胺尾巴并未模拟赖氨酸。他们发现UNC8732在培养基中被代谢为醛，并推测是FBS中的胺代谢酶介导了UNC8732的转化。加入广谱胺代谢酶抑制剂AG后，确实抑制了UNC8732介导的NSD2降解。在无血清的培养基中，NSD2也未被降解（图8）。
图 8. a. UNC8732的转换；b-f. 血清介导UNC8732的转化
作者试图合成醛，但未成功，最终合成了纯净的α羟基磺酸盐。该化合物UNC10088可以介导NSD2的降解，且活性强于UNC8732，并可在溶液中自发转化为醛（图9）。
图9.α羟基磺酸盐自发水解并结合靶标蛋白
通过BioID技术，作者发现FBXO22可能是介导NSD2降解的目标E3连接酶。使用BRET技术表征细胞内FBXO22和NSD2的互作，发现二者在UNC8732的存在下被诱导聚集。使用siRNA敲除相关泛素连接酶组分，抑制了NSD2的降解。最后，使用BLI表征了UNC10088介导的三元复合物（图10）。
图10. 寻找E3以及三元复合物验证
研究还发现，一级胺对降解活性至关重要，若将伯胺改为仲胺，化合物则会丧失降解能力。作者使用DSF技术表征了UNC10088与FBXO22的结合，通过氢氘交换质谱确定了小分子与FBXO22的结合位置，发现326位的半胱氨酸可用于共价反应。C326突变后，化合物无法诱导NSD2降解。
——小结——
第一篇研究提出了一个大胆的假设：小分子上的末端氨基可以模拟赖氨酸。实验表明，这些小分子在体外人工条件下确实可以被泛素化，但后续缺乏更深入的机制验证。第二篇研究则更加扎实，成功确定了FBXO22是介导NSD2降解的靶蛋白，并明确了结合位点。不知道读者更喜欢哪个故事呢？
参考文献：
[1] den Besten, W.; Verma, K.; Yamazoe, S.; Blaquiere, N.; Phung, W.; Izrael-Tomasevic, A.; Mulvihill, M. M.; Helgason, E.; Prakash, S.; Goncharov, T.; et al. Primary amine tethered small molecules promote the degradation of X-linked inhibitor of apoptosis protein. J. Am. Chem. Soc. 2021, 143 (28), 10571-10575. DOI: 10.1021/jacs.1c05269.
[2] Nie, D. Y.; Tabor, J. R.; Li, J.; Kutera, M.; St-Germain, J.; Hanley, R. P.; Wolf, E.; Paulakonis, E.; Kenney, T. M. G.; Duan, S.; et al. Recruitment of FBXO22 for targeted degradation of NSD2. Nat. Chem. Biol. 2024. DOI: 10.1038/s41589-024-01660-y.
