今天分享的文章是一篇2019年发表在Nature Chemistry上的文章Rapamycin-inspired macrocycles with new target
specificity，通讯作者是约翰霍普金斯医学院的Jun O. Liu.，该课题组近年构建了FK506/雷帕霉素类似物库，试图发现基于FKBP的分子胶。
雷帕霉素/FK506这些天然大环化合物，在体内先与FKBP（FK506-binding -protein）结合形成二元复合物，二元复合物会和第二个蛋白结合进一步形成三元复合物，最终发挥药物的功能。受此启发，作者试图构建一系列雷帕霉素/FK506类似物，希望找到新的FKBP-雷帕霉素类似物-靶蛋白的互作对。方法：保留雷帕霉素与FKBP结合部分（FKBD），用四肽替换掉雷帕霉素中mTOR结合的部分，构建了4万余个类似物。天然产物往往以意想不到的机制发挥作用，这给药物设计提供了灵感。雷帕霉素/FK506就是这样的分子。它们进入细胞后，会首先和FKBP家族蛋白结合，尤其是FKBP12，形成二元复合物。FKBP12-雷帕霉素复合物会靶向mTOR，进一步形成三元复合物，导致mTOR激酶活性被抑制；FKBP12-FK506类似物会靶向calcineurin(一种磷酸酶)，抑制Ca2+依赖的信号传导及T细胞激活。结构上，FK506和雷帕霉素可简单地划为两个部分：1）FKBP结合片段2）效应片段（结合效应蛋白：calcineurin或mTOR）（Fig 1）。![]()
Figure 1. 雷帕霉素与FK506结构，蓝色部分为FKBP结合片段，FKBD，红色部分为效应片段二者FKBP结合片段非常类似，而效应片段有较大差别。通过替换效应片段构建雷帕霉素类似物，是否可以找到新的能够诱导三元复合物的大环？（Fig 2）这是本文的主要问题。注：就在本文发表的第二年（2020），就又发现了雷帕霉素类似物（WDB002，诱导FKBP12与CEP250蛋白形成复合物）。前人的工作已经合成了类似的化合物，这些多肽衍生物保留了与FKBP的结合，但没有活性。
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Figure 2. 作者的设想，用四肽替换掉现有天然产物的效应片段
作者之前也做过类似的尝试，包括构建大的FKBP衍生物库（但库中化合物丧失了对FKBP的结合）。本文是作者的后续成果，构建了一个45000的雷帕霉素衍生物库，从中成功鉴定出ENT1的抑制剂。
Rapafucin的合成：作者使用固相合成+split pool策略去组装四肽。具体反应路径如下所示，1）将带有烯烃的仲胺linker固定在beads上，2）四肽的羧基与仲胺缩合，固定四肽（Fig 3）。
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Figure 3. 固定Linker和四肽
3）FKBD的羧基与四肽末端氨基缩合，固定FKBD（Fig 4）![]()
Figure 4. 固定FKBD
4）通过烯烃复分解，将FKBD中的烯烃与仲胺linker连接，一步完成关环和脱beads（Fig 5）。![]()
Figure 5. 通过烯烃复分解关环并脱Beads
优化点1：对linker的筛选。trans构型的烯烃C5只有较低的关环产率，cis构型的产率高于trans构型，其中C6,C8高于C4，但是C8的产物不单一，所以最后选择了cis-C6（Fig 6）。![]()
Figure 6. Linker的选择
优化点2：FKBD上烯烃片段对反应产率的影响，结论是作者选取的几种结构，都不影响烯烃复分解的产率。
优化点3：反应温度、反应时间、催化剂用量等。
优化点4：不同FKBD对FKBP的亲和力。FKBD3是直接从雷帕霉素上截取而来，FKBD6是基于SLF(Synthetic Ligand of FKBP)而来。线性化的FKBD3对FKBP12的亲和力相较于雷帕霉素下降了三百倍（(Kd = 327 nM for FKBD3 and 1nM for rapamycin)），将FKBD3环化，亲和力有一定的提升（Kd = 174 nM）；FKBD7-9对FKBP的亲和力严重下降，提示更刚性的酰胺键不如酯键；线性化的SLF衍生物FKBD6对FKBP亲和力较强（Kd = 62 nM），但成环以后活性大幅丧失。将FKBD6中刚性的苯环用脂肪链替代，得到了FKBD10（Kd = 4 nM），FKBD11(Kd = 11 nM)。将二者环化之后，活性仅有轻微下降，FKBD10（Kd = 25 nM），FKBD11(Kd = 37 nM)。不同的环化不会导致含FKBD10,11的大环对FKBP的亲和力下降（Fig 7）。
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Figure 7. FKBD的结构
化合物库的合成：以FKBD10，11和cis-c6 linker为基础开始构建化合物库。首先是构建四肽效应片段。氨基酸选择带有疏水侧链的天然/非天然氨基酸。同时将2，4位氨基酸胺基甲基化封闭，用于改善分子整体性质。使用split-pool策略固相合成四肽。1-4位每个位置上氨基酸残基可用数为15，10，15，10，一共构建了15 x 10 x 15 x 10 = 22500个四肽片段。每个片段可以和FKBD10和11成环，所以一共合成了45000个雷帕霉素衍生物（rapafucin），FKBD10系列环原子数36，FKBD11系列环原子数34。至此化合物构建完成（Fig 8）。![]()
Figure 8. 四肽部分的构建及两类终产物的结构式
基于细胞表型的筛选体系：筛选能够抑制细胞胸腺嘧啶核苷摄取的化合物，发现FKBD10系列中的一个pool的化合物有较好的抑制活性。将这15个化合物单独合成并验证活性，只有三个化合物有亚微摩尔活性，最好的化合物活性为426 nM。将四肽的顺序颠倒后重新与FKBD10成环，得到的化合物SH-13抑制活性为 366 nM。对SH-13进行三轮改造后得到活性最强的化合物95-15-3（Rapadocin），抑制细胞胸腺嘧啶核苷摄取的IC50为5 nM（Fig 9）。![]()
Figure 9. a）Rapadocin结构式 b）Rapadocin抑制胸苷摄取
ENT1是Rapadocin的靶点：Rapadocin对表达hENT1的PK15细胞的腺苷转运有明显抑制（IC50 = 3.2 nM），而对表达hENT2的细胞几乎没有抑制活性，重要的是，这一活性是FKBP依赖的（Fig 10）。![]()
Figure 10. 左图Rapadocin选择性抑制PK15-hENT1细胞腺苷转运，右图Rapadocin对胸苷转运的抑制部分依赖于FKBP12
通过模仿天然产雷帕霉素，作者成功找到了hENT1的抑制剂Rapadocin，且Rapadocin发挥功能部分依赖于FKBP12。雷帕霉素和FK506的靶点都是细胞内的蛋白质，而Rapadocin的靶点为膜蛋白，扩充了分子胶靶点蛋白的范围。Guo, Z.,
Hong, S.Y., Wang, J.et al. Rapamycin-inspired macrocycles
with new target specificity. Nature Chem 11, 254–263
(2019). https://doi.org/10.1038/s41557-018-0187-4
