4月8日，Revolution Medicines在Nature上发表了RAS抑制剂RMC-7977的临床前研究，文章标题为“Concurrent inhibition of oncogenic and wild-type RAS-GTP for cancer therapy1”。去年8月24日我们就在公众号和大家分享过他们的RMC-4998分子，当时是一篇Science。各种背景在这篇公众号中已有介绍，本文不再赘述。和RMC-4998分子类似，本文新披露的分子—RMC-7977，通过诱导CYPA、RAS形成三元复合物，干扰RAS与其它蛋白的互作。本篇的亮点在于：RMC-4998是共价化合物，只对KRAS G12C有效，而RMC-7977是非共价化合物，对野生型以及多种突变型RAS均有效。RAS癌基因(NRAS、HRAS，尤其是KRAS)是癌症中最常发生突变的基因之一，常见的突变发生在codon 12、13和61处。目前已有两款KRAS G12C抑制剂获批上市，但KRAS G12C突变只占KRAS突变癌症的15%左右，这一比例在中国人中可能更低。因此开发泛KRAS抑制剂有重要临床意义。RMC-7977是泛RAS抑制剂，对野生型、突变型的KRAS、NRAS及HRAS均有效。临床前试验结果表明RMC-7977对多种RAS突变的癌症模型非常有效，尤其是携带KRAS G12X（X代表任意氨基酸）突变的肿瘤。泛RAS抑制活性使得 RMC-7977有望成为一种广谱抗癌药物。不同于sotorasib和adagrasib这些靶向KRAS GDP结合状态的小分子，RMC-4998及7977靶向KRAS GTP结合状态，它们发挥作用的方式更像分子胶（molecular glue）而不是双功能分子(bifunctional molecule) （原文：The mechanism of action of these inhibitors is distinct from that of bifunctional immunophilin-binding inhibitors with independent RAS- and CYPA-binding motifs joined by a linker2, and instead reflects the binding mechanism of multiple natural products that inspired a paradigm for inhibiting undruggable targets）。RAS蛋白的绝大多数突变都难以使用共价抑制剂靶向（G12C有一个可供靶向的半胱氨酸，而G12D/G12V等缺乏共价反应基团）。作者们前期发现了与野生型KRAS弱结合的非共价先导化合物1（cpd-1），SPR测得cpd-1-CYPA复合物的Kd为862 nM，cpd-1-CYPA-KRAS（G12V）复合物的Kd为6550 nM；.cpd-1在Capan-1细胞（携带KRAS G12V突变的胰腺导管癌）上对ERK磷酸化抑制的EC50为632 nM,对细胞增殖抑制的EC50为960 nM。在经历了一系列结构改造后，得到活性最强的分子RMC-7977（图1）（构效关系细节被隐去，原文中仅有粗略的描述）。SPR测得RMC-7977-CYPA复合物的Kd为195 nM，RMC-7977-CYPA-KRAS（G12V）复合物的Kd为85 nM；RMC-7977在Capan-1细胞上对ERK磷酸化抑制的EC50为0.421 nM，对细胞增殖抑制的EC50为2.20 nM，结合活性和细胞活性都有巨大提升。该化合物口服生物利用度F = 63%。此外，RMC-7977、CYPA单独在体外测不到与GMPPNP-KRAS（GTP-KRAS类似物）有结合。![]()
图1. a）化合物结构 b）三元复合物形成示意图
RMC-7977-CYPA-KRAS（G12V）复合物结构（图2）显示，在CYPA与KRAS之间有一空槽，而G12、G13、Q61就处在其中，这为RMC-7977广谱抑制KRAS多种突变提供了结构基础。作者还得到多个KRAS突变体的三元复合物晶体结构，在所有的KRAS G12X突变中，RMC-7977都表现出一致的结合模式。![]()
图2. 三元复合物中间的沟槽，足以容纳各种突变的残基在细胞上，BRET试验表明RMC-7977可以快速[(t1/2) < 5 min]诱导KRAS/CYPA结合以及KRAS/CRAF RBD的解离（图3a）。不同KRAS突变体的RAS/CYPA结合EC50与RAS/CRAF解离EC50呈正相关（图3b）。![]()
为了验证CYPA/ RMC-7977二元复合物的形成对细胞活性至关重要，作者使用了竞争性CYPA抑制剂或敲除编码CYPA的基因（PPIA），结果表明，在NCI-H441 (KRAS G12V, NSCLC)和AsPC-1 (KRASG12D, PDAC)细胞中，RMC-7977抑制RAF-MEK-ERK信号和增殖需要CYPA结合（图4）。![]()
图4. de）使用竞争性CYPA抑制剂 fg）敲除PPIA后，RMC-7977活性丧失 hj）PPIA位点的破坏不影响对mek1 /2选择性抑制剂曲美替尼的敏感性作者用缺乏PPIA的NCI-H358 (KRAS G12C, NSCLC)细胞构建了高/低表达CYPA的两种亚型，高表达CYPA的细胞对RMC-7977更敏感（图5）。这些结果说明RMC-7977的发挥作用依赖于细胞内RMC-7977/CYPA复合物的形成，而这又依赖细胞本身CYPA的表达量。![]()
图5. 高表达CYPA的细胞对RMC-7977更敏感作者考察了15个细胞系中的CYPA含量，结果表明CYPA浓度较高，中位浓度12.3 μM（图6）。最后，CYPA在多种癌症中大量表达，且在患者间表达差异较小，这表明肿瘤细胞中CYPA的量足够支撑RMC-7977发挥效力。![]()
图6. 多种细胞系中的CYPA的浓度（包含肺癌、结直肠癌、宫颈癌等）作者还比较了RMC-7977在携带各种RAS通路相关突变的癌细胞中的活性，特别是KRAS、NRAS、EGFR或BRAF的致癌变体。用RMC-7977处理的RAS依赖性(KRAS, NRAS或EGFR突变)癌细胞在低纳摩尔范围内表现出浓度依赖性的下游信号传导和增殖抑制（图7）。![]()
图7. RMC-7977对携RAS相关突变的细胞活性较强使用PRISM assay对RMC-7977在869种癌细胞上的细胞活力抑制进行分析，结果表明携带KRAS突变的细胞系对RMC-7977治疗最敏感（图8）。图8. KRAS突变对RMC-7977治疗最敏感，BRAF突变则不敏感作者接着在183个携带RAS及RAS通路突变的人类癌细胞系上测试RMC-7977的活性。KRAS G12X突变细胞系对RMC-7977高度敏感，中位EC50为2.40 nM，非12位的 KRAS突变次敏感，EC50为25.1 nM（图9）。![]()
图9. RMC-7977对KRAS G12X突变细胞系生长效果最强在NCI-H441模型中，小鼠对RMC-7977（10 mg/kg，每日一次）耐受良好，治疗28天后平均肿瘤消退83%。在更大规模的15个携带KRAS相关突变的PDAC、CRC、NSCLC CDX和PDX模型上，RMC-7977治疗导致肿瘤生长抑制并诱导多种肿瘤消退（图10）。![]()
后续作者还证明RMC-7977可以克服现有KRAS抑制剂耐药等，原文有更详尽描述，欢迎读者阅读原文。Revolution Medicines是分子胶领域的前沿探索者，他们将这一设想，即利用小分子劫持细胞内广泛存在的蛋白来抑制肿瘤相关蛋白，推向更高更深的层次，目前他们已有分子进入一期临床试验。 这篇文章相对于去年发表的Science，仍称得上重大突破。在与RAS的结合方面，化合物从RMC-4988的共价机制变为RMC-7977非共价机制，成功将化合物从KRAS G12C抑制剂转变为 RASmulti抑制剂，对多种RAS突变均有效果，这对于扩展适应症是极为有利的，我们将持续关注这些分子的临床试验结果。1 Holderfield, M. et al. Concurrent inhibition of oncogenic and wild-type RAS-GTP for cancer therapy. Nature (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07205-6
2 Zhang, Z. & Shokat, K. M. Bifunctional Small‐Molecule Ligands of K‐Ras Induce Its Association with Immunophilin Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 58, 16314-16319 (2019). https://doi.org/10.1002/anie.201910124
