基于P450选择性氧化的天然产物化学-酶法合成进展

随着基因挖掘、生物信息学、酶工程等多学科的交叉融合与协同创新，将绿色高效的酶催化反应与现代有机合成方法相结合的化学-酶法合成策略逐渐发展成为合成活性天然产物、药物分子和其他具有重要价值的有机分子的有力工具。其中细胞色素单加氧酶P450能够选择性地实现惰性C—H氧化这一经典的挑战性化学转化，为活性天然产物的高效合成提供了新的思路，成为合成科学领域的研究热点之一。本文以结构类型进行分类，综述了P450选择性氧化在甾体、萜类以及其他类型天然产物化学-酶法合成中的应用进展，并分析了相应的酶催化反应在提高目标产物合成效率方面起到的关键作用。此外，还讨论了该领域目前所面临的挑战，例如主要集中在对酶天然功能的利用，并缺乏对反应位点的准确预测等；同时从酶资源挖掘、酶的改造等多个角度出发展望了未来能够为这些挑战提供解决方案的研究方向和新兴技术，包括高通量筛选技术、AI辅助酶工程等等。

天然产物骨架多样、结构丰富、活性出色，是药物发现的重要来源。但由于分离提取的收率低、重现性差以及后期结构修饰困难，无法可持续且经济可行地为后续深入的药物化学研究提供充足的物质基础，严重制约了基于天然产物的药物研发工作。为了突破这一研究瓶颈，利用新技术和新方法围绕高效、经济、规模的目标开发合成策略，快速实现具有显著生物活性的天然产物及其类似物的多样性合成显得尤为重要。

近年来，随着基因挖掘、生物信息学、酶工程等多学科的交叉融合与协同创新，将绿色高效的酶催化反应与现代有机合成方法相结合的化学-酶法合成策略正逐渐发展成为合成活性天然产物、药物分子以及其他具有重要价值的有机分子的有力工具。化学-酶法策略能够有效地将酶催化成本低廉、绿色高效、条件温和、选择性好的优势和传统有机合成方法底物普适性强、容易实现多样性合成的特点相结合，使得二者取长补短、优势互补，从而解决了传统合成路线中的关键难题，提高目标产物的合成效率。

选择性的惰性C—H键直接氧化便是经典合成化学中的挑战性转化之一，近年来不断涌现的C—H键活化方法能够部分解决这一挑战。但由于目标分子结构复杂且含有很多化学性质相似的C—H键，该策略在天然产物合成中的应用还值得深入探究。而生物代谢中很多重要的氧化酶，如细胞色素P450单加氧酶、黄素依赖型单加氧酶、铁/α-酮戊二酸加氧酶以及非特异性过氧化酶等能够以专一的区域和立体选择性实现底物的选择性氧化，并且避免定位基团和保护基团的参与以及其他不必要的“非结构性”转化，与现有的化学方法形成良好的补充。除此之外，定向进化等酶工程手段可以在催化效率的提升、催化剂稳定性的优化和反应底物的拓展等方面提供帮助，为酶催化反应的开发带来独特的优势。

其中，细胞色素P450单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenases）是一类含有B 型血红素（heme B）的蛋白超家族。其特征在于血红素辅因子的铁中心和蛋白中的半胱氨酸残基轴向连接，在电子供体Fe/S簇蛋白的帮助下生成Fe(Ⅱ)—O₂复合物，并通过后续电子传递得到Fe(Ⅳ)=O卟啉阳离子自由基。这一高价的铁氧物种可作为强氧化剂很容易地从结合的底物分子中的惰性sp³碳原子上夺取一个氢原子，产生相应的底物碳自由基，并通过快速的“氧回补”实现羟基化（图1）。除了羟基化之外，P450催化剂具有广泛的活性，能够在温和的条件下催化环氧化、C—C键氧化偶联、C—C键氧化断裂、氧化脱烷基化等多种不同类型的选择性氧化反应。这些高效的转化能够为目标产物的合成设计提供新的思路，不仅被广泛应用于香料、维生素、杀虫剂和药物分子的生产中，也成为了复杂天然产物合成与结构修饰的有力工具。本综述将以天然产物的类型进行分类，讨论P450酶在天然产物化学-酶法合成中的应用。

1  P450选择性氧化在甾体化学-酶法合成中的应用

甾体类药物因其优异的生物活性，如抗感染、抗炎、抗过敏和抗肿瘤活性等，已成为仅次于抗生素的第二大类药物，预计2025年全球市值将超过170亿美元。而P450介导的惰性C—H键羟基化是一类对甾体药物非常重要的转化，其出色的区域和立体选择性不仅使这类反应能够用于甾体药物的合成、后期修饰及其代谢模拟，也能够作为“化学抓手”为其他结构复杂的甾体药物提供高效的半合成方案。

1.1  stereonsteroids的化学-酶法合成

甾体的C19位羟基化是雄性激素向雌性激素转化的关键步骤，在经典化学中通常需要以Norrish反应、Barton光裂解以及Suárez反应为关键步骤实现。然而这些化学转化往往反应条件苛刻，并需要定位基团的参与，导致了底物范围窄、反应步骤冗长等缺点，制约了后续的生物学和药效学研究。而在生物转化中，一些Pellicularia属的丝状真菌能够直接实现皮质酮类结构C19位甲基的选择性羟基化。受此启发，周强辉与瞿旭东课题组在2019年合作报道了stereonsteroid B 等6种C19羟基化的甾体的高效合成（图2）。

首先，作者通过对瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris NBRC 6298）中的P450酶进行挖掘，确定了可作用于可托多松（cortexolone，1a）C19位的目标酶TCP450-1。但鉴于该酶异源表达的效率较低，在进行规模制备时依然基于瓜亡革菌的全细胞生物转化进行优化。以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为共溶剂，当使用乙酰基保护C17位羟基并增加Fe²⁺浓度时，能够将反应转化率提高4倍，规模制备5 g羟基化产物2，使得该反应具备活性天然产物合成的应用价值。2通过二醇的氧化断裂能够“一锅法”转化为C19-羟雄烯二酮（3），再经由2～4步反应便可转化成炔诺酮（norethisterone， 4）等10多种C19-去甲甾体药物的前体。除此之外，2经过TMSI选择性脱除C17位羟基可转化为高级中间体5，并通过多步转化完成C17位侧链的氧化切断和重构，实现了stereonsteroid A（6）、ceratosteroid D（7）、sclerosteroid A（8）等6个C19羟基化甾体的合成，并修正了sclerosteroid B（11）的化学结构。

1.2  bufotalin等强心苷的化学-酶法合成

强心苷是一类广泛分布于自然界中的甾体天然产物，除了被用作强心剂之外，还具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等活性，活跃于多项临床研究中。这类天然产物吸引了众多合成化学家的关注，在目前的合成路线中C14位羟基的引入主要依赖前期官能团的转化，导致合成效率较低。2022年，戈惠明、谭仁祥和俞寿云等从价格便宜的雄烯二酮（androstenedione，13）出发，利用P450酶催化高效引入C14位羟基，成功实现了强心苷天然产物bufotalin（18）、 bufogenin B（19）、 digitoxigenin （21）的高效合成（图3）。

首先，他们选取能够产生强心苷分子的植物牛角瓜（Calotropis gigantea）和宿主动物蟾蜍（Bufo gargarizans）作为研究对象进行了P450酶挖掘，分别发现了CYP11411和CYP44476两种酶，能够氧化孕酮（progesterone，12）和雄烯二酮（androstenedione，13）C14位产生α-OH， 其中CYP44476还能够催化甾体的C6、C9、C15位形成羟基[图3(a)]。但由于上述酶的异源表达转化效率较低，因此他们最终采用新月弯孢菌（Curvularia lunata CGMCC 3.9012）以二甲基亚砜（DMSO）作为共溶剂进行全细胞生物转化，能够以70%的分离产率得到克级规模的C14α-OH-雄烯二酮（14）。随后，通过消除和Mukaiyama水合等多步化学转化实现了C14位羟基立体构型的翻转，并得到共同中间体15。从该化合物出发，通过与锡试剂16进行Stille偶联，引入了六元不饱和内酯环，构建了强心苷的基本骨架，再经氧化态调整和保护基脱除，完成了bufotalin（18）和bufogenin B（19）的合成。同样以15作为中间体，以马来酸酐参与的类S_N2自由基偶联作为关键策略，成功引入了五元内酯环，并通过苯基硒衍生物氧化等转化得到了目标产物digotoxigenin（21）[图3(b)]。

1.3  periplogenin等强心苷的化学-酶法合成

鉴于甾体C14位羟化酶CYP11411和CYP44476异源表达效率低、底物范围受限的缺点，近期瞿旭东与周强辉课题组合作通过菌株筛选、基因挖掘以及在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的异源表达，从新月弯孢菌（C. lunata）中挖掘了一个新的C14α羟化酶CYP14A。作者利用RoseTTaFold预测了其与孕酮（progesterone，12）的结合模式，并通过饱和突变和迭代饱和突变的方式获得了两株性能优良的突变体I111L-V124W和I111L-M115K，提高了反应的区域选择性，特别是CYP14A I111L-V124W在甾体底物（12，22～24等）上均展现出良好的结果[图4(a)和(b)]。

为了验证该反应的合成应用价值，作者以两个具有较高药用价值的强心甾天然产物， digitoxigenin（27）和periplogenin（31）为目标展开了合成研究[图4(c)]。以22为起始原料，DMSO为共溶剂，通过全细胞生物转化可以在克级规模以68%的收率得到C14羟基化产物25。经过催化氢化和消除对25的官能团进行调整后，利用Bestmann叶立德试剂构建五元内酯环可以得到共同中间体26。随后，分别使用L-selectride和NaBH₄对C3位羰基进行还原，得到两种构型不同的醇，再经由Mukaiyama水合反应以6步完成(+)-digitoxigenin（27）、(+)-3α-hydroxyldigitoxigenin（29）及其他两个C3位和C14位非对映异构体的合成。同样从25出发，经过相似的反应转化可以得到30，随后经环氧化、选择性环氧开环和C3位羰基还原等五步反应，以9步完成了天然产物periplogenin（31）的高效无保护基合成。

1.4  trenbolone等甾体药物的化学-酶法合成

trenbolone（34）是一种睾酮类似物，其C11和C12位的双键减缓了代谢速度，显示出作为睾酮的治疗替代品的巨大潜力（图5）。在前人的合成路线中需要从32出发通过4步化学转化得到，合成效率较低。2020年，Reetz、李爱涛等合作对P450_BM3进行定向进化，得到了突变体LG-23，可以实现睾丸酮（testosterone）等六个甾体天然产物C7β位C—H键的选择性氧化，极大地提高了C7官能化效率。在随后的研究中，李爱涛课题组发现当该突变体作用于32时，反应位点会发生变化，能够以极高的选择性实现C11α位的羟基化。随后，他们通过对T438位点的定点饱和突变得到了LG-23/T438S，进一步提升了催化活性和反应选择性。利用Cochliobolus lunatus中的17-甾酮还原酶（17β-HSDcl），他们构建了重组全细胞催化剂大肠杆菌（LG-23/T438S+HSDcl），使用粗酶裂解液，以DMF为共溶剂，同时实现了甾体（32）C11α位的羟基化以及C17位的羰基还原，在PTSA存在下进行选择性脱水得到了trenbolone（34），并快速合成用于预防疯牛病的trenbolone acetate（35）。

C7功能化甾体药物显示出了作为神经保护和抗炎剂治疗中风、脑创伤和脑缺血等慢性神经元损伤的重大潜力。但已有的生产方法涉及费力且对环境不友好的五步化学转化，导致效率低。通过相似的多酶级联策略，李爱涛课题组利用“一锅两步法”在P450_BM3突变体LG-23和酮还原酶17β-HSDcl/V161G的全细胞催化下，以克级规模先后实现了androstenedione（13）C7β位的羟基化和C17位的羰基还原，为mibolerone（38）等C7功能化甾体药物的关键前体37提供了更加高效的合成方案。

2  P450选择性氧化在萜类化学-酶法合成中的应用

2.1  萜类生物碱nigelladine A的化学-酶法合成

nigelladine A（48）是一种分离自Nigella glandulifera的去甲二萜生物碱，具有高度共轭的骨架结构特征，并表现出优异的蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）抑制活性（图6）。2017年，Stoltz和Arnold课题组以后期C—H键选择性氧化为关键策略，合作完成了该分子的首次全合成。整条合成路线从烯酮39出发，将其转化为肼40之后再经过酰化、水解、甲基化三步反应得到β-酮酯41。随后以42为手性配体通过不对称烯丙基化反应以87% ee值得到化合物43。再通过Tsuji-Wacker氧化、Robinson环化以及羰基α位溴代反应合成偶联前体44。紧接着，与片段45进行Suzuki偶联并且脱保护、缩合构建了天然产物的基本骨架。最后，在C7位选择性氧化的过程中，作者尝试了多种已知的烯丙基氧化方法，但是反应的区域选择性差，且无法有效分离。因此，他们对P450_BM3的突变体进行了筛选，发现最初作用于糖类化合物选择性氧化脱保护的突变体P450_BM3 8C7对化合物47展现出了最优的效果。作者以DMSO为共溶剂直接使用粗酶裂解液进行反应，能够以>2.5∶1的区域选择性得到C7位选择性氧化的产物。该反应可以在160 mg的规模进行，并且通过与醇脱氢酶（ADH）/异丙醇组成的NADPH再生体系联用，极大地降低了成本。随后在Dess-Martin氧化剂的作用下，以两步21%的收率得到了目标天然产物nigelladine A（48）。

2.2  phenylpyropene等α-吡喃酮类杂倍半萜的化学-酶法合成

3-羟基补身烷结构是α-吡喃酮类杂倍半萜的核心骨架结构，这类天然产物具有出色的生物活性，是潜在的酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶（ACAT）抑制剂和乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂。为了对其生物活性和构效关系展开深入研究，多位合成化学家完成了该家族天然产物的全合成，常见的合成策略主要包括以多烯串联环化为核心的线性合成以及从Wieland-Miescher酮出发的模块化组装，但二者均存在反应效率低和选择性欠佳的问题。Renata课题组的合成路线从酶催化的香紫苏内酯（49）选择性氧化开始，将亚磷酸脱氢酶Opt13与P450_BM3突变体MERO1联用，实现了反应过程中NADPH的循环，极大地降低了生产成本（图7）。以DMSO为共溶剂，使用粗酶裂解液可以克级制备C3-β-OH-香紫苏内酯（50）。然后通过四步反应对内酯环进行氧化切断得到β-羟基醛（51）。随后，结合形式[3+3]环加成和氢原子转移（HAT）还原等高效转化，完成了arisugin F（58）、phenylpyropene C（59）以及pyripyropene E（60）的合成。共同中间体52也可被转化为酰氯53，再经Friedel-Crafts酰基化、环化、还原羰基，最终以较高的收率得到phenylpyropene F（61）。

2.3  taondiol等杂二萜的化学-酶法合成

完成上述α-吡喃酮杂倍半萜的化学-酶法合成之后，Renata课题组又将目光投向了taondiol、chevalone A等活性杂二萜（图8）。由于MERO1对起始原料香紫苏醇（62）的羟基化活性较低，他们将后者经五步反应转化为羧酸63，并对反应过程产生的所有中间体进行了酶催化反应筛选，发现突变体MERO1 L75A对羧酸63的C3羟基化活性最高，以重组大肠杆菌裂解液为生物催化剂，DMSO为共溶剂，能够以62%分离产率在克级规模选择性引入羟基。一方面，64经Barton脱羧转化成碘化物66，进一步消除后可得到二烯67，这两个化合物均为后续合成的共同中间体。其中碘化物66分别与68和69发生Ni催化的还原偶联，能够以较高的收率得到对应的偶联产物，再分别经过两步反应构建D环，完成了taondiol（71）和chevalone A（72）的合成。另一方面，二烯中间体67与吡喃酮（57）发生单电子转移的[3+2]环加成反应得到decaturin E（73）；在电化学的条件下与70发生类似的环加成反应，再经氢原子转移氢化、脱除甲基得到了stypodiol（74）。

2.4  chrodrimanins等trans-syn构型补身烷类杂倍半萜的化学-酶法合成

补身烷类天然产物一般由萜烯环化酶催化环氧多烯通过全椅式过渡态环化生成，得到热力学稳定的trans-anti-trans构型；然而，少数天然产物则通过热力学不稳定的船式过渡态以trans-syn类构型存在。这一类型的天然产物具有较高的合成挑战性，前人通过经典化学合成以及萜烯环化酶参与的化学-酶法合成策略进行了合成研究，但均存在效率差、对映选择性低、合成路线长等缺陷。2021年，Renata课题组以C9位差向异构化的香紫苏内酯（75）为起始原料，结合P450酶生物氧化策略，实现了chrodrimanin C（87）等4种trans-syn构型的补身烷类杂倍半萜的合成（图9）。

对于polysin（78）和N-acetyl-polyveoline（79）的合成，可以从酸性条件下香紫苏内酯（49）C9位的差向异构化开始。经过针对产物75的P450_BM3突变体筛选，他们发现原本用于甾体羟基化的突变体KSA15具有一定的底物杂泛性，能够以中等的收率实现C3位的羟基引入。随后，以Smith-Madelung吲哚合成以及蒙脱土K10介导的Friedel-Crafts环化为关键策略，经过4步转化同时得到了trans-syn-cis构型的C环化和N环化的产物，可经由官能团的调整分别以7步和8步的总步骤转化为polysin（78）和N-acetyl-polyveoline（79）。对于chrodrimanin C（87）和verruculide A（88）的合成同样从9-epi-香紫苏内酯75出发，经过Arndt-Eistert反应等五步转化可得到trans-syn-trans构型的δ-内酯80。以DMSO为共溶剂在粗酶裂解液的作用下，该内酯能够以82%的产率在克级规模实现C3位选择性的羟基化，保障了后续路线的顺利开展。羟基化的中间体81经由两步转化后与烯炔83发生Sonogashira偶联得到84。这一关键中间体通过Pt催化选择性硅氢化反应，以及CuOTf参与的6π电环化和氧化芳构化完成天然产物骨架的构建，并选择性引入硅基作为后续转化的化学抓手。最后，经由Cu催化的Ullaman-Ma偶联等三步反应引入酚羟基，完成chrodrimanin C（87）的全合成，并在Saegusa氧化的条件下得到verruculide A（88）。值得一提的是，上述的四个天然产物均为首次合成报道。

2.5  柠檬苦素gedunin的化学-酶法合成

柠檬苦素类化合物是一类含有呋喃环并且高度氧化的四降三萜类天然产物，具有广泛的结构多样性和药理作用，吸引了诸多合成化学家的关注。其中，gedunin（95）是一种具有出色HSP90抑制活性的D环-seco-柠檬苦素，高度氧化的碳环骨架和拥挤的B/C/D三环体系使其具有较大的合成挑战性，目前仅有Renata课题组从香紫苏内酯出发，以P450_BM3突变体催化的选择性羟基化为关键策略完成了该分子的全合成（图10）。

虽然香紫苏内酯可直接进行C3位羟基化，但为了避免过多保护基的使用，他们希望能够在合成的中后期引入羟基。于是，通过甲基化内酯开环、Baeyer-Villiger氧化、臭氧化和消除三步反应得到烯酮89。随后，以DMSO为共溶剂，在MERO1 L437A粗酶裂解液的作用下，得到C3位氧化产物90。另外，他们采用Krische报道的Ir催化不对称烯丙基化反应为关键策略构建了片段91。片段90和91在Luche偶联条件下，以93%的收率得到92，后者经过Wittig反应、Dess-Martin氧化可得到二酮93。烯丙位氧化后紧接着在Giese偶联条件下完成天然产物核心骨架的构建，得到环化产物94。然后，94经过Saegusa氧化、环氧化等四步转化，最终以最长线性步骤13步实现了高度氧化的天然产物gedunin（95）的全合成。

2.6  excolide B等的化学-酶法合成

在上述以香紫苏内酯及其衍生物作为酶催化底物的天然产物化学-酶法合成中，选择性氧化的位点均集中在A环的C3位。实现多位点的选择性氧化有助于拓展其后续转化的化学空间，能够进一步提高复杂天然产物的合成效率。2022年，Renata课题组发现原本作用于睾丸酮（testosterone）C7位羟基化的P450_BM3突变体LG-23能够以较低的转化率在香紫苏醇62的C6位引入α-羟基，基于迭代饱和突变进行两轮定向进化后，突变体LG-23 L181F L437G能够将催化效率提升6倍，并体现出一定的底物杂泛性。作者以DMSO为共溶剂，在LG-23 L181F L437G的粗酶裂解液作用下，能够以66%的产率得到克级规模的B环氧化产物96，并应用于合成抗HIV活性天然产物ansellone B（102）（图11）。96经过连续两步氧化反应实现C9位侧链的氧化切断，得到了C6-α- OH-香紫苏内酯（100）。再对其进行TBS保护之后，通过α-羟基化等三步转化便可以7步的总步骤得到ansellone B（102）合成中的高级中间体101。与Tong课题组报道的合成路线相比，Renata课题组采用的酶催化反应能够实现羟基的快速选择性引入，将合成路线缩短了10步。同时，在两种不同的P450_BM3氧化酶突变体的协同作用下，可以分别实现香紫苏醇A环C3位和B环C6位的选择性氧化，得到不同氧化度的香紫苏醇衍生物（97~99等）。两个羟基位点的引入带来了更多的反应可能性，通过仿生的骨架断裂和重排反应，实现了化合物98中A环的切断，完成了excolide B（103）的首次合成。这体现了羟基的引入不仅可以作为天然产物的官能团，同时也可以成为复杂化学转化的抓手。

2.7  ent-kaurane，ent-atisane，ent-trachylobane类型二萜的化学-酶法合成

ent-kaurane、ent-atisane、ent-trachylobane是三种在生源合成中密切关联的二萜天然产物家族，它们具有广泛的生物活性，能够抑制离子通道、信号传导级联以及炎性小体，结构上的差异主要在于其C/D环的连接方式。由于分子结构复杂，从简单原料出发的从头合成难度较大；而从甜菊醇等天然原料出发的半合成策略也因缺乏骨架修饰的化学工具而受到较大限制，难以广泛应用。利用Shen等对平板霉素生物合成过程中表征的多个羟化酶，Renata课题组对这三类骨架的酶催化选择性氧化展开了研究（图12）。其中，Fe/αKG依赖型氧化酶PtmO6能够以较高的催化活性实现B环C7位的羟基化；将P450酶PtmO5与还原酶伴侣RhfRed进行融合后，并在分子伴侣GroES和GroEL的存在下，可以提高甜菊醇C环C11位羟基化的效率。除此之外，通过对该课题组特色的P450_BM3突变体元件库进行筛选后发现MERO1 M177A能够选择性地氧化A环，得到C2位羟基化产物。Renata课题组结合三种不同酶参与的选择性氧化策略分别实现了上述3类天然产物家族A、B、C环系的选择性氧化，以多个酶的联用完成了10个高氧化度二萜活性天然产物的化学-酶法合成。

C7和C11氧化的ent-kaurane家族天然产物rosthornins的合成从甜菊醇（104）出发， 首先在纯酶PtmO6的生物催化下，以DMSO为共溶剂，实现C7β C—H键的氧化，并在后续化学氧化中转化为酮105（图12）。后者可以在PtmO5-RhfRed粗酶裂解液的作用下，以DMSO为共溶剂，在C11位以65%的产率引入羟基，得到106。随后，通过4步反应实现C7、C15和C19位氧化态的调整，完成了该家族两个天然产物rosthornin B（108）和rosthornin C（107）的高效合成。甜菊醇104还可直接利用融合酶PtmO5-RhfRed，经过同样的生物催化方式，实现C11位羟基化，酸性条件下成醚并且甲酯化，得到笼状环醚109。然后，化合物109经过Barton脱氧等6步转化，最终以9步实现了fischericin B（110）的全合成。

紧接着，他们意外发现以异甜菊醇（111）作为底物时，PtmO5-RhfRed的氧化位点从C11位转移到了C12位，为C/D环的碳正离子重排提供了化学抓手。在TfOH的作用下，112通过Wagner-Meerwein重排可以得到ent-atisane骨架113。在MERO1 M177A粗酶裂解液的生物催化下，以DMSO为共溶剂，能够得到C2位羟基化的中间体114，并经由Wolff-Kishner脱氧得到生物碱cochleareine合成的关键前体115。与此同时，113还可以被还原为醇，并在BF₃·OEt₂和Et₃SiH的作用下进行还原性重排得到ent-trachylobane骨架116。从116出发，经MERO1 M177A和PtmO6酶催化反应先后在C2和C7位引入羟基，并由PDC氧化得到二酮化合物118。后者可以继续在PtmO6的作用下得到C6位羟基化的产物119，并在甲酯化、DMP氧化等条件下转化为mitrephorone C（120）。在该天然产物的合成过程中，作者先后使用了4次酶催化羟基化，分别在C/A/B环上选择性引入氧化度，极大缩短了合成路线。在同一篇报道中，他们还合成了这三个家族其他一些天然产物，由于没有用到P450氧化酶，这里不做赘述。

3  P450选择性氧化在其他类型天然产物化学-酶法合成中的应用

3.1  聚酮aureothin的化学-酶法合成

aureothin（126）是链霉菌Streptomyces thioluteus中分离得到的一种较为罕见的含硝基聚酮类天然产物，具有抗癌、抗真菌、杀虫等多种活性（图13）。之前的合成研究表明，如何对映选择性地实现四氢呋喃环的构建是合成这一天然产物的主要难点。而在生物合成途径中，该结构是通过一个独特的双功能P450酶AurH对C9α和C7位连续氧化实现的。2008年，Hertweck课题组以该酶催化转化为关键策略完成了aureothin的首次不对称合成。以四氮唑乙酯121为起始原料，通过Julia烯化等四步转化后可以得到不饱和酯122。后者经甲基化得到123，随后转化为有机Sn试剂用于后续的Stille偶联。在与芳基碘124偶联后，通过全细胞生物转化的方式，以DMSO为共溶剂，在P450酶AurH的作用下可以实现羟基化进而安装呋喃环，以中等收率得到最终的天然产物（126）。

为了进一步提高合成效率，该课题组在2012年对合成路线进行了优化。作者通过1,3-二噻烷与不饱和吡喃酮共轭加成，串联与溴代物的亲核取代反应，“一锅法”完成天然产物骨架的构建。随后利用化合物127通过氧化脱硫和羰基还原以50%～64%收率得到外消旋体128。作者通过相同的生物催化方式，在P450单加氧酶AurH的催化下，消旋的128可经过动力学拆分过程以42%收率和99% ee值得到aureothin（126）。这一汇聚式的合成路线极大缩短了合成步骤，为其他aureothin类似物的合成提供了基础。

3.2  糖肽类抗生素vancomycin苷元类似物的化学-酶法合成

糖肽类抗生素万古霉素（vancomycin）被认为是治疗细菌感染的最后防线。它是一个化学结构独特的刚性七肽，含有6个非经典氨基酸、3个大环、2个芳环C—O—C醚键以及1个联苯C—C键。虽然许多知名的合成化学家如Nicolaou、Boger、Evans等完成了万古霉素的化学合成，但其合成依然具有极高的难度，主要的挑战包括芳环C—O—C键和C—C键的构建。其生源合成研究揭示了三个P450酶的存在，即OxyB、OxyA以及OxyC，可完成两个芳环C—O—C键和C—C键的构建。

通过固相多肽合成可得到线性七肽130，再与辅酶A（CoA）相连得到化合物131（图14）。CoA可将多肽呈递给X结构域和多肽载体蛋白（PCP）。X结构域可以招募OxyA、OxyB等P450酶，在无共溶剂条件下，作用于两个芳环C—O—C键的偶联。2018年，Seyedsayamdost课题组首次获得了具有体外活性的充足蛋白OxyC，并利用化学酶法完成了vancomycin骨架的搭建。相似的策略也被应用于糖肽类抗生素keratinimicin苷元衍生物的化学-酶法合成中。

3.3  大环内酯类抗生素juvenimvin等的化学-酶法合成

juvenimicin和M-4365属于强效的大环内酯类抗生素，在结构上由16元大环内酯苷元和二甲基氨基糖组成。2017年，Sherman课题组探索了juvenimicin生物合成中的两种末端聚酮合酶（PKS），并结合糖基化和P450介导的选择性氧化实现juvenimicin家族多个天然产物合成。关键的中间体138通过Myers辅基参与的不对称烷基化反应构建，在与片段139发生HWE偶联后，通过硫酯形成得到140（图15）。后者在PKS装配线末端的两个模块TylGIV和TylGV的作用下，延长碳链并大环内酯化得到苷元tylactone（141）。随后，将苷元141在Streptomyces venezuelae DHS316中进行孵育，能够以中等的收率得到糖苷化产物M-4365 G₁（142）。从该化合物出发，在纯化的TylI、JuvD和MycCl等P450酶催化下，以DMSO为共溶剂，分别在骨架的C20、C12/C13和C23位引入氧化度，并得到了活性更为出色的类似物147，展示了这类酶催化剂在复杂天然产物后期结构修饰方面的巨大潜力。

3.4  环酯肽cryptophycin类似物的化学-酶法合成

这一策略还被应用于其他环肽类天然产物以及类似物的合成中。cryptophycin是分离自蓝藻的一类含有16元大环结构的缩酚酸肽类活性天然产物，表现出强大的诱导微管蛋白解聚的能力。其中，其类似物cryptophycin 52（155）曾被用于治疗非小细胞肺癌和耐铂卵巢癌，但因体内疗效有限，在临床Ⅱ期终止。现有的合成路线显示，这类天然产物主要的合成挑战集中在选择性的大环内酯化和环氧化。为了解决上述难题，Sherman课题组利用硫酯酶催化的大环内酯化反应和P450酶CrpE催化的选择性环氧化反应针对cryptophycin及类似物开发了一条高效的合成路线（图16）。片段150可以从148和149出发通过HWE烯烃合成和Suzuki偶联合成。之后通过常规的酰胺偶联和脱保护操作得到环化反应的线性前体152。随后以纯酶CrpTE为生物催化剂，无共溶剂条件下，可实现不同芳基取代底物152的大环内酯化，该反应具有较广的底物杂泛性。将P450酶CrpE与还原伴侣Fdr/Fdx融合可提高酶催化的效率、降低反应的成本，作者以大环内酯153为底物，尝试了该融合酶催化的选择性环氧化反应。作者将纯酶CrpE作为生物催化剂，在无共溶剂条件下，能对多种芳基杂环底物实现环氧化，得到化合物154，为后续的构效关系研究奠定了物质基础。

本综述总结了基于P450选择性氧化的天然产物化学-酶法合成进展。其中，P450酶能够以出色的区域和立体选择性在温和的条件下解决惰性C—H键选择性官能化这一经典合成中的挑战性转化，符合绿色化学的未来发展要求。在合成化学家对目标天然产物进行逆合成分析时，有意识地将酶催化反应融入经典合成路线不仅能够提供全新的切断方式、改变合成设计的思路，更有助于提高合成效率、缩短合成路线并应用于活性天然产物的结构改造和构效关系研究。为了将P450氧化这一酶催化反应更好地整合进天然产物的化学-酶法合成，需要生物合成、化学合成、合成生物学、酶工程、机器学习等多个学科的共同努力。

首先，从拓展酶催化反应化学空间的角度出发，不应只局限于P450酶的天然功能。在上述化学-酶法合成案例中， P450酶主要被用来选择性地引入羟基或实现C—C键的偶联等，反应类型较为单一。Arnold、Fasan等多个课题组利用P450突变体生成铁卡宾中间体，用于C—C、C—N、C—Si、C—B构建以及环丙烷化等多种非天然反应类型；杨扬课题组成功改造了P450酶用于立体选择性的原子转移自由基环化（ATRC）反应。上述工作进一步拓展了P450酶的非天然功能，也展示了这类新于自然（New-to-Nature）反应活性的开发能够实现更多的挑战性转化，具有在天然产物等复杂分子合成中应用的潜力。

其次，酶催化剂的发现效率需要进一步提升。一方面，伴随着高通量测序方法的发展和DNA数据的积累，数字化的基因组挖掘不仅能够指导新的活性天然产物发现，也有助于表征其生物合成过程中的关键酶，不断丰富酶催化元件。另一方面，新兴研究手段能够助力酶的工程化改造。例如，Arnold课题组利用计算建模、机器学习极大地缩减了定向进化的实验工作量，同时实现了两种立体选择性的Si—H键的卡宾插入反应。

除此之外，其他一些多学科的交叉融合的研究手段也能够加速P450酶催化反应的开发，拓展其应用范围。例如，更加直接、可视化的高通量检测手段有助于筛选效率的提升；结合AI大数据的机器学习能够预测P450氧化反应在复杂底物上的反应位点，有望实现反应选择性的“指哪打哪”；酶催化逆合成分析软件的开发有助于合成化学家更好地理解和运用酶催化反应。总而言之，目前基于P450选择性氧化的天然产物化学-酶法合成研究受到了越来越多的关注，跨学科、多领域的技术进步为合成化学与合成生物学的研究搭建了沟通的桥梁，在不久的将来包括P450在内的酶催化反应有望成为合成化学家解决挑战性问题的常规工具。

李付琸研究员，致力于开发酶催化反应解决经典有机合成中的挑战性转化，为活性天然产物和药物分子的合成提供新的思路；以高效绿色的化学-酶法合成路线为活性天然产物构效关系研究提供物质基础。目前，在Nat. Chem.、Nat. Synth.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed. 等本领域高水平学术期刊发表论文十余篇；以第一发明人获得专利授权1项；获得“国家海外高层次人才引进青年项目”和“上海海外高层次人才引进计划”支持。