光酶催化混乱性反应的研究进展

光催化具有条件温和、可再生、反应性强等优点，然而由于自由基的高活性往往导致其选择性难以调控，限制了光催化在不对称有机合成中的广泛应用。酶催化虽具有高选择性和专一性的优势，但这也导致其存在反应类型单一和底物谱窄等缺陷。将反应性强的光催化与选择性高的酶催化相结合的光酶催化则可以提供一种全新的合成模式，实现优势互补，更加符合现代绿色有机合成的要求。狭义的光酶催化反应，也就是光酶协同反应一般包括以下四类：天然光酶反应，人工光酶反应，光催化与酶催化的偶联反应以及光酶催化混乱性反应。近年来，光酶催化的研究蓬勃发展，解决了许多传统有机合成中难以实现的问题，尤其是在不对称合成领域已占据重要地位。例如，脂肪酸光脱酸酶可以催化长链脂肪酸脱羧转化为相应烃类；结合光敏辅因子和蛋白骨架的人工光酶大大拓展了酶的应用范围，催化更多样化非天然有机化学品的生物合成；光催化剂催化光化学反应与酶催化反应的偶联方式可以实现一些复杂的有机合成过程；以及近年来一些含有光敏辅因子的氧化还原酶在光激发下催化新分子混乱性反应的功能。尽管已有许多文献对相关研究进行了总结，但是自2023年以来，光酶催化混乱性研究不断突破，涌现出许多全新的光酶催化反应类型和反应机理，立体选择性和区域选择性的精准调控更是满足了不对称合成的重大需求。对于这个飞速发展的领域，系统归纳其成果仍显得至关重要。因此本综述聚焦在光激发下光敏辅因子依赖型酶催化的混乱性反应最新研究成果，根据不同催化反应类型，分别介绍光酶通过自由基途径实现不对称脱卤、氢化、分子内环化、分子间C—C/C—N/C—S键交叉耦合等非天然反应。这些反应由于酶和底物的不同，展示了不同机理。例如在氧化还原起始过程中，包括单电子还原起始和单电子氧化起始两种类型；在自由基终止过程中，可能采用单电子还原终止和单电子氧化终止，而单电子还原终止方式中也存在氢原子转移和电子转移/质子转移耦合过程等不同情况。机理的多样性也为拓展更多的光酶催化混乱性反应提供了可能。在未来，新型的光酶催化方法将在快速发展的基因工程、合成生物学、酶工程，以及流动化学、人工智能等学科和技术的推动下，涌现出更多高效、高选择性的新分子新功能反应，显著拓展光酶催化方法在有机合成（尤其是绿色不对称合成）领域中的应用范围。

自1912年化学先驱Ciamician发表题为“未来的光化学”演讲以来，如何将自然界中丰富的光能转化为可利用的化学能已成为科研工作者探寻的热点问题之一。由于有机分子往往只能吸收太阳光中能量较高的紫外光子部分，早期的光催化反应经常因紫外激发导致有机分子的碳碳键断裂而无法得到目标产物。近些年，随着新型过渡金属催化剂、光催化剂以及光吸收材料的大量开发，光催化有机合成领域迎来了发展高峰。尽管光催化反应具有条件温和、官能团耐受性好、反应性强等优点，在实际应用中却往往难以实现对反应的区域、化学、立体选择性的精准调控。

随着生物工程手段的蓬勃发展，酶催化凭借其反应条件温和、绿色环保、区域选择性及对映选择性高等优势，在有机合成化学中占据越来越重要的地位。但是酶天然可催化的反应类型相对有限，底物谱较窄，使得其应用受到了一定的限制。将光催化和酶催化结合的光酶催化可以实现优势互补，在高选择性的基础上极大拓展应用范围，有助于充分发挥其在高价值手性化合物合成中的优势。

狭义的光酶催化反应（也就是光酶协同反应）一般包括以下4类：天然光酶反应，人工光酶反应，光催化与酶催化的偶联反应以及光酶催化混乱性反应。目前报道的自然界中存在的天然光酶仅有3种类型：修复紫外损伤DNA的DNA光解酶、催化原叶绿素酸酯还原的光依赖型原叶绿素酸酯氧化还原酶（light-dependent NADPH：protochlorophyllide oxidoreductase，LPOR）以及催化脂肪酸脱羧生成烃类化合物的脂肪酸光脱羧酶（fatty acid photodecarboxylase，FAP）。除此之外，人工光酶的提出也实现了很多在传统有机合成中难以进行的化学转化。而光催化剂催化光化学反应与酶催化反应的偶联方式可以实现一些复杂的有机合成过程。自然界中还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）[reduced nicotinamide adenine dinucleotide (phosphate)，NAD(P)H]或黄素（flavins）辅因子依赖型酶的种类繁多、数量庞大。2016年，Hyster团队深度挖掘了NAD(P)H的光敏特性，并在NAD(P)H依赖型酮还原酶（keto-reductases，KERD）中首次实现了非天然的不对称脱卤反应。随后这些辅因子的光敏特征逐渐被认识并充分利用。在可见光的激发下，这些光敏辅因子依赖型的酶可以通过自由基途径实现不对称脱卤、氢化、分子内环化、分子间C—C/C—N/C—S键交叉耦合等非天然反应。本文聚焦在光激发下光敏辅因子依赖型酶催化的混乱性反应最新研究成果，根据不同催化反应类型，介绍近年来相关的代表性研究工作，对其中涉及的机理也进行了阐述。

1  非天然光酶反应

1.1  自由基脱卤

2016年，Hyster团队在Nature上发表了非天然光酶催化领域的开创性工作（图1）。NAD(P)H依赖型的酮还原酶KRED天然可以催化羰基化合物的还原，该文作者将光照引入酶催化体系中，实现了自由基介导的不对称脱卤非天然反应，生成了不同构型的手性内酯化合物。通过酶的筛选，在来源于开胃乳酸杆菌（Lactobacillus kefiri）的短链脱氢酶（LkADH）中获得了ee值高达96%、产率高达91%的R构型产物；在来源于罗尔斯通氏菌（Ralstonia species）的短链脱氢酶（RasADH）中获得了ee值94%、产率82%的S构型产物。

通过一系列的机理实验，该文作者对KRED催化的非天然脱卤反应提出了可能涉及的机制：首先辅因子再生体系将NAD(P)⁺还原成NAD(P)H，基态NAD(P)H受光激发可以从弱单电子还原剂转化为强单电子还原剂。底物和NAD(P)H在KRED活性空腔中形成电子供体-受体（electron donor-acceptor，EDA）复合物，激发态的NAD(P)H和底物之间发生单电子转移（single electron transfer，SET），引发C—Br键断裂，Br^–离去后生成了前手性烷基自由基中间体。随后在不同酶的活性空腔中，通过NAD(P)H介导的氢原子转移（hydrogen atom transfer，HAT）过程最终生成不同构型的手性内酯化合物，同时NAD(P)H转化为NAD(P)⁺，完成光敏辅因子的催化循环。

在NAD(P)H依赖型KRED实现不对称脱卤反应的基础上，2017年Hyster团队首次利用黄素腺嘌呤单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）依赖型的烯还原酶（ene-reductases，ERED）实现了非天然的自由基脱卤反应[图2(a)]。机理实验表明该反应利用酶活性空腔中FMN氧化还原状态的转变催化反应：氧化态的FMN（oxidized state of FMN，FMN_ox）在NADPH的作用下被还原生成基态的氢醌FMN（hydroquinone state of FMN，FMN_hq），FMN_hq与底物在酶的活性空腔中发生SET，底物脱去卤素离子并生成烷基自由基中间体，FMN_hq转化为半醌态FMN（semiquinone state of FMN，FMN_sq）。最后烷基自由基中间体在FMN_sq介导的HAT作用下生成手性酯类化合物，同时FMN_sq转化为FMN_ox完成FMN的催化循环。值得注意的是，在无光照的条件下，基态FMN_hq可以直接驱动反应的进行。

2018年，Hyster团队进一步发展了光催化剂和酶协同作用的新型催化体系，拓展了非天然的光酶催化自由基脱乙酰氧基/脱卤反应[图2(b)]。该文作者在来源于烟草（Nicotiana tabacum）的双键还原酶NtDBR的体系中引入了光催化剂孟加拉玫瑰红（Rose Bengal，RB），RB受光激发转化为RB*，RB*在NADPH介导的SET作用下转化为RB^·–。与酶活性空腔结合的α-乙酰氧基四氢萘酮底物在RB^·–的SET作用下，乙酰氧基离去生成α-羰基碳的自由基中间体，同时生成RB完成光催化剂的催化循环。α-羰基碳自由基中间体随后在NADPH介导下的HAT作用下获得手性产物。另外，将光催化剂曙红Y（Eosin Y）与KRED结合的体系也可以协同催化α-溴酰胺底物的自由基不对称脱卤反应。

2022年，吴起和徐鉴团队在黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）依赖型的Baeyer-Villiger单加氧酶CHMO中实现了α,α-氟氯酮选择性还原脱卤，并通过“聚焦理性迭代定点突变”（focused rational iterative site-specific mutagenesis，FRISM）的策略，获得了突变株L144A和L435V，以极高的产率（>99%）和对映体比例（enantiomeric ratio，e.r.）（e.r.>99∶1）获得S构型的α-氟代酮化合物（图3）。与以往提出的脱卤反应机理不同的是，该文作者经过氘代、计算模拟等一系列机理实验后提出，在CHMO光催化非天然脱卤反应的体系中，自由基中间体的猝灭并不经过HAT，而是依赖电子转移/质子转移（electron transfer/proton transfer，ET/PT）的过程实现，缓冲液中的水充当了自由基猝灭的氢供体。

1.2  不对称氢化

黄素FMN依赖型的ERED天然可以催化活化烯烃底物的立体选择性还原，然而对羰基类底物的还原却鲜有报道。2019年，Hyster团队提出在Ru(bpy)₃Cl₂光催化剂的辅助下，来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的吗啡酮还原酶MorB可以通过一种新的光酶催化途径催化芳香酮化合物的还原，拓展了ERED催化还原反应的底物谱[图4(a)]。机理实验显示：首先，MorB活性位点附近的关键残基N189与H186分别负责了底物的锚定与活化，NADH将FMN_ox还原为FMN_hq。光催化剂Ru^(Ⅱ)受光激发转化为Ru^(Ⅱ)*，Ru^(Ⅱ)*被猝灭后转化为具有强还原性的Ru^(Ⅰ)。随后，MorB空腔内Ru^(Ⅰ)和底物之间发生SET过程产生羰基自由基中间体与Ru^(Ⅱ)，羰基自由基在FMN_hq介导的HAT作用下生成还原产物和FMN_sq。最后FMN_sq再与Ru^(Ⅱ)*之间发生SET，生成FMN_ox，完成黄素的催化循环。

2022年，Poelarends和Saravana团队将这一策略扩展到了其他酶的催化体系中[图4(b)]。作者发现来源于解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的黄素依赖型硝基还原酶BaNTR1亦可以促进多种羰基化合物的光酶催化不对称还原。与Hyster团队提出的MorB催化体系相比，BaNTR1展现出更高的对映选择性，此外，BaNTR1不仅不会还原双键或三键，还能够促进α,β-不饱和酮转化成高对映选择性的仲醇，遗憾的是其具体的催化机制尚未明确。

2020年，Hyster团队也将该策略应用于缺电子的乙烯基吡啶类化合物的不对称还原[图5(a)]。在光催化剂Ru(bpy)₃Cl₂的辅助下，来源于点型念珠蓝细菌（N. punctiforme）的烯还原酶NostocER可以高效、高选择性地催化乙烯基吡啶的还原。

2023年，黄小强和王斌举团队将ERED光催化的底物范围进一步拓展到了烯胺类化合物，为手性胺化合物的合成提供了新方法[图5(b)]。来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的老黄酶1（OYE1）及其突变株可以高效合成R构型的手性胺化合物，e.r.值高达99∶1。机理实验表明：NADPH还原FMN_ox至氢醌阴离子态（FMNH^–），FMNH-受光激发后转化为激发态的FMNH^–*，随后与底物发生SET后生成自由基阴离子中间体，FMNH-转化为FMNH˙，最终自由基阴离子中间体在FMNH˙介导的HAT作用下实现烯胺的手性还原，同时完成FMN的催化循环。

1.3  自由基环化

2019年，Hyster团队发现部分ERED，如来源于氧化葡萄糖杆菌（Gluconobacter oxydans）的GluER突变株T36A，来源于干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的LacER，来自念珠藻（Nostoc sp.）的NostocER和MorB等均能催化含有烯基的α-氯酰胺类底物选择性的自由基环化，生成不同构型的具有β或γ-立体中心的五元环至八元环的手性内酰胺化合物[图6(a)]。机理实验表明：在酶的活性空腔中，NADPH还原FMN_ox至FMN_hq，FMN_hq和底物形成了EDA复合物，光激发下底物在FMN_hq的SET作用下脱卤生成α-羰基自由基中间体，FMN_hq转化为FMN_sq，α-羰基自由基与双键加成并最终通过FMN_sq介导的HAT生成手性内酰胺类化合物。同时，FMN_sq被氧化为FMN_ox，完成黄素的催化循环。

通常来讲，产生稳定的自由基是光酶催化自由基环化的前提条件。2020年，Hyster团队利用烷基碘作为不稳定的亲核自由基前体，在光照下诱导底物分子内的对映选择性自由基环化[图6(b)]。机理实验表明：在GluER的活性空腔中，NADPH还原FMN_ox至FMN_hq，FMN_hq和底物形成了电子转移（charge transfer，CT）复合物，光激发后底物在FMN_hq的SET作用下脱去碘离子生成不稳定的烷基自由基中间体，FMN_hq转化为FMN_sq，烷基自由基中间体随后经过FMN_sq介导的HAT作用下生成了手性内酯、酰胺等化合物，同时FMN_sq被氧化为FMN_ox完成黄素的催化循环。

2023年，饶义剑、周景文和袁振波团队利用GluER突变株W100H对2′-肉桂氧基-2-溴乙酰苯酮进行不对称脱卤环化反应[图6(c)]，高效制备了十几种含氧苯并杂环化合物（产率高达99%，ee值高达99%）。值得一提的是，本研究成功实现2′-肉桂氧基-2-溴乙酰苯酮（3.03 mmol）的大量反应，以86%的分离产率（658 mg）和>99%的ee值获得了R构型产物，且其可以转化为具有高分离产率（95%）和ee值（>99%）的高价值手性苯肼。这类刚性的双环化合物很难通过传统的氢烷基化工艺获得，因此这项研究进一步证明了利用非天然光酶催化合成具有生物活性的高价值手性化合物的实用性。

2023年，Daidone团队通过分子模拟和氨基酸突变等手段进一步解释了ERED催化α-氯酰胺脱卤环化的自由基反应的手性来源。与通常认为的π面进攻模式不同，该文作者提出在酶空腔中，前手性过渡态的稳定性虽然决定了反应的立体选择性，但是前手性过渡态的稳定性不是与酶的相互作用直接相关，而是取决于在不同的EREDs空腔中底物分子中C—N—C—C原子构成二面角。

1.4  分子间C—C键形成反应

在过去50年中，由过渡金属催化的交叉耦合反应极大改变了复杂有机分子的合成方式。近年来，可见光诱导下的酶催化反应为构筑手性C—C键提供了一个温和高效的策略。该体系初期多用于分子内键的形成和断裂，随后也成功应用于分子间的C—C键交叉耦合，凸显其在有机合成领域的应用潜力。

1.4.1  缺电子自由基对烯烃的氢烷基化反应

2020年，赵惠民团队提出了光激发下ERED催化α-卤代羰基化合物和末端烯烃之间交叉耦合的新策略[图7(a)]。作者通过不同的ERED成功合成了不同构型的γ-手性羰基化合物：老黄酶OYE1适合催化芳基酮类底物；来自伯氏耶尔森菌（Yersinia bercovieri）的YersER适合催化酰胺类底物；来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的XenA适合催化酯类底物。该策略高效、高选择性地合成了一系列含有远程γ立体中心的酮、酰胺或酯化合物，进一步扩大了生物催化在不对称合成方面的应用范围。机理实验表明：在ERED的活性空腔中，NADPH还原FMN_ox至FMNH^–，FMNH^–和底物形成EDA复合物，受光激发后底物在FMNH^–的SET作用下生成α-羰基自由基中间体，FMNH^–转化为FMNH^•，随后α-羰基自由基中间体与末端烯烃发生加成生成新的自由基中间体，最后在FMNH^•介导的HAT作用下生成γ-手性羰基化合物，同时FMNH^•被氧化为FMN_ox，完成黄素的催化循环。

2023年，Hyster团队提出，如果光酶催化的非天然反应体系中，前手性自由基中间体不被HAT猝灭，而是被水捕获后发生羟基化，则可以获得手性叔醇类化合物[图7(b)]。通过酶的筛选与定向进化，该文作者利用MorB突变株高效合成了多种手性羟基化产物。机理实验表明：酶活性空腔中FMN_hq与α-卤代芳香酮底物形成CT复合物，光激发下底物在FMN_hq的SET作用下脱卤生成了碳中心的自由基中间体，FMNH^–转化为FMNH^•。碳中心的自由基中间体进而与烯烃发生加成生成新的自由基中间体，该自由基进攻羰基氧发生五元内环化后形成α-氧自由基，随后该自由基被FMN_sq氧化后生成碳𬭩阴离子并水解形成手性叔醇产物，同时完成黄素的催化循环。

2024年，赵惠民团队在老黄酶OYE1中实现了光酶催化氮杂芳环底物的远程γ位手性调控[图7(c)]。机理实验表明：FMN_hq与溴代吡啶形成的CT复合物受光激发，经过SET过程引发溴代吡啶脱卤，生成吡啶苄基自由基中间体，随后与α-甲基苯乙烯发生加成生成前手性碳中心自由基中间体，最后经过FMN_sq介导的HAT作用下高效合成了多种γ-手性中心的氮杂芳环类化合物，突破了有机合成领域中对平面刚性的氮杂芳环远程手性中心控制的难题。2023年，Hyster团队也报道了从α-氯代吡啶底物合成远程γ-手性中心氮杂芳环化合物的类似方法。

2022年，徐鉴和贾义霞团队利用重氮化合物作为自由基前体，在酶的空腔中实现了与末端烯烃化合物的光催化自由基立体选择性加成[图7(d)]。在黄素依赖型酶OYE1和OPR1的作用下，高效合成了多种γ-手性羰基化合物。

1.4.2  富电子自由基对不饱和键的加成反应

除了卤代化合物或重氮化合物能够作为自由基的前体外，羧酸的氧化还原活性酯类化合物，例如常见的N-(酰氧基)邻苯二甲酰亚胺（N-hydroxyphthalimide，NHPI）酯也是重要的自由基前体之一，其可以通过光诱导脱羧生成自由基。2022年，赵惠民和王斌举团队开发了光激发KRED催化苄基-NHPI酯的N—O键断裂，随后自发脱羧生成苄基自由基并与缺电子烯烃耦合的方法，合成了多种手性α-酯类化合物[图8(a)]。

2023年，朱敦明、吴洽庆和冯进辉团队提出了光催化剂与酶串联催化不对称合成1,2-氨基醇的新方法[图8(b)]。光催化剂Eosin Y受光激发生成Eosin Y^*，并与底物N-苯基甘氨酸发生SET生成Eosin Y^˙–，与此同时，底物脱羧后产生烷基自由基中间体，该自由基中间体与醛发生加成后生成新的O-中心自由基中间体，并在Eosin Y^˙–的SET作用下生成消旋氨基醇。RasADH在辅因子NADP⁺的作用下选择性催化R构型的氨基醇生成氨基酮和NADPH，NADPH还原Eosin Y^*生成Eosin Y^˙–和NADPH^˙+，Eosin Y^˙–与氨基酮发生SET生成羰基自由基中间体和Eosin Y，进而通过NADPH^˙+介导的HAT过程生成消旋的氨基醇和NADP⁺，从而实现了光催化和酶催化协同作用下对氨基醇的动态动力学拆分，最终高效、高选择性地合成了S构型的1,2-氨基醇化合物。

2024年，Hyster团队报道了另一例利用光催化剂和酶协同催化自由基选择性脱羧烷基化的反应[图8(c)]。该文作者将老黄酶3(OYE3)与Ru(bpy)₃²⁺光催化剂结合，催化氨基酸脱羧生成自由基中间体，与缺电子的乙烯基吡啶发生自由基偶联，随后在FMN_hq介导的HAT作用下生成了多种手性吡啶胺化合物。

非天然氨基酸（non-canonical amino acid，ncAA）结构多样、应用广泛，存在于各种天然产物、药物分子中。吡哆醛5′-磷酸（pyridoxal 5ʹ-phosphate，PLP）依赖型酶能高效、特异性地合成和降解氨基酸，省去了传统的ncAA化学合成中对氨基和羧基保护及去保护等烦琐过程。2023年，杨扬和刘鹏团队开发了一种光催化剂与酶协同催化产生吡哆醛自由基的新方法，实现了多手性中心ncAA的高效合成（图9）。机理实验表明：光催化剂罗丹明B（Rhodamine B，RhB）受光激发转化为RhB^*，与烷基三氟硼酸盐底物发生单电子氧化生成碳中心自由基中间体和RhB^˙–。与此同时，吡哆醛5′-磷酸（PLP）依赖型酶催化丝氨酸或者其他的β-羟基-α-氨基酸生成亲电氨基丙烯酸酯，并与碳中心的自由基中间体结合生成亲电的氮杂烯丙基自由基中间体。随后经过RhB^˙–介导的ET/PT或质子耦合电子转移（proton-coupled electron transfer，PCET）过程生成手性ncAA，同时完成RhB的催化循环。

1.4.3  C(sp³)-C(sp³)成键反应

高立体选择性C(sp³)-C(sp³)交叉亲电耦合（XEC）是有机化学中长期存在的一大挑战，近年来，光酶催化体系也为更高难度的XEC提供了新的思路与方法。

2022年，Hyster团队利用来源于柄杆菌（Caulobacter segnis）的烯还原酶CsER实现了α-氯代羰基化合物和硝基烷烃之间的高化学选择性和立体选择性XEC[图10(a)]。机理实验表明：光催化脱卤获得的α-酰胺自由基与亚硝酸盐迅速生成自由基负离子，随后经历不可逆的脱硝基生成烷基自由基中间体，最终由FMN_sq介导的HAT过程猝灭，生成了多种S构型的β-酰胺化合物。然而在不同酶的空腔中，上述机理还有其他的可能。2023年，Hyster团队在利用来源于嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus）的老黄酶GkOYE催化时发现，底物生成自由基负离子中间体后没有发生脱硝基而是发生SET过程，最终生成多种手性β-硝基酰胺化合物[图10(b)]。

1.4.4  自由基-自由基交叉偶联反应

焦磷酸硫胺素（thiamine diphosphate，ThDP）依赖的苯甲醛裂解酶（benzaldehyde lyase，BAL）可以催化苯甲醛与安息香之间的可逆反应。受此启发，科研工作者发展了多种氮杂环卡宾（N-heterocyclic carbenes，NHC）化合物，并成功运用于自由基反应中。2024年，黄小强、梁勇与田长麟团队利用来源于荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的苯甲醛裂解酶PfBAL开发了一种光催化剂与酶协同催化的新方法，实现了羰基自由基与烷基自由基的自由基-自由基交叉耦合，高效合成了多种手性羰基化合物（图11）。机理实验表明，Eosin Y受光激发生成Eosin Y*，在PfBAL的活性空腔中底物醛和ThDP形成的Breslow中间体发生单电子氧化生成稳态的羰基自由基和Eosin Y^˙–，Eosin Y^˙–可以还原苄基-NHPI酯底物生成瞬态的前手性苄基自由基，并与稳态的羰基自由基中间体发生自由基-自由基交叉耦合，生成多种取代的手性酮化合物，同时完成Eosin Y的催化循环。

1.5  C—N键形成反应

N中心的自由基是一类多功能的、高反应性的合成中间体，然而与经典的C中心自由基相比，N中心的自由基很容易被还原，因此如何高效构建C—N键仍然是有机合成领域的一个巨大挑战。

2023年，Hyster团队开发了一种光催化剂与酶协同催化产生N中心自由基的新方法，实现了分子内对映选择性的自由基氢胺化反应[图12(a)]。来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的YqjM和光催化剂Ru(bpy)₃Cl₂协同催化，可以将羟基酯转化为对应的R或S构型的氢胺化产物。机理实验表明：光激发Ru^(Ⅰ)与酶活性空腔中非共价结合的底物羟胺酯发生SET，生成N自由基中间体，该自由基与双键加成生成苄基自由基中间体，随后通过FMN_hq介导的HAT作用生成手性内酰胺产物以及FMN_sq，FMN_sq还原激发态的Ru^(Ⅱ)*生成Ru^(Ⅰ)和FMN_ox，完成光催化剂与黄素的催化循环。

2023年，赵惠民、王斌举和仲冬平团队将这种光酶催化产生N中心自由基的策略应用于分子间的自由基氢胺化反应[图12(b)]。作者设计了一种含有N—O键离去基团的氨基甲酸酯作为N中心自由基的前体，在来源于恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）的烯还原酶XenB空腔中，光激发FMNH^–与底物之间发生SET，底物N—O键断裂生成N中心自由基中间体与FMNH^•，N中心自由基中间体进而与末端烯烃化合物发生自由基加成，最终在FMNH^•介导HAT作用下生成手性产物。

1.6  C—S键形成反应

2023年，徐鉴团队报道了一例自由基介导的立体选择性磺酰化的光酶催化新方法[图13(a)]。在蓝光照射下，通过定向进化手段获得的OYE1突变株能催化磺酰氯脱卤生成S中心自由基中间体，并与末端烯烃底物发生自由基加成，生成新的自由基中间体。随后在酶活性空腔中的酪氨酸（Y196）介导的HAT作用下高效合成一系列R构型的β-手性磺酰化合物。此项工作为手性磺酰基化合物的合成提供了一种新方法，并进一步拓展了黄素依赖型酶的应用。

对映选择性磺酰基化也能够通过以单电子氧化为起始的机理实现。2024年，叶俊涛、丁蓓和戴少波团队利用GluER突变株W100F/W342F，成功高效合成了数十种高对映选择性的(S)-β-磺酮化合物，同时也通过OYE1^Y196F合成(R)-β-磺酮（32%的产率，95∶5的e.r.）[图13(b)]。机理实验显示：受光激发的FMN_ox促进磺酸盐的单电子氧化产生磺酰基自由基和FMN_sq。随后，所得的磺酰基自由基与α-甲基苯乙烯加成，生成了一个前手性碳自由基中间体。FMN_sq被水质子化形成中性的FMNH^•。最后，前手性碳自由基中间体被由酪氨酸介导的氢原子转移过程猝灭。与传统的单电子还原启动的反应相比，这种氧化机制不依赖于底物和辅因子之间的EDA复合物形成，因此为多样化的高价值化合物的合成提供了更大的平台。

1.7  C—H官能团化

C—H键作为有机化合物中最为普遍的化学键，其官能团化备受科研工作者的关注。尽管过渡金属催化的C—H键活化已成为一种强有力的合成手段，然而在绿色以及经济性上仍然有着一定的不足。近年来光酶催化领域的迅速发展，为惰性C—H键活化提供了新方法。

2023年，受自然界中FAD依赖型FAP的脱羧机理的启发，黄小强、王斌举和田长麟团队开发了一种直接激发富电子的噻吩底物生成芳基自由基的光酶催化新方法（图14）。作者选择了3-甲氧基噻吩和α-甲基苯乙烯作为模型底物，在加入光催化剂核黄素5-单磷酸钠盐（FMN-Na）的情况下分别筛选出了选择R构型的烯还原酶GluER以及选择S构型的老黄酶OYE1。在底物拓展实验中，该方法对多种富电子的杂环以及苯环均显示出了良好的产率和选择性。机理实验表明：ERED活性空腔中FMNox受光激发后转化为激发态FMNox*，FMNox*夺取了富电子芳烃的电子产生芳基自由基阳离子中间体以及FMNsq，随后芳基的自由基中间体与烯烃发生自由基加成形成前手性中间体。最后，前手性中间体在酶活性位点FMNsq介导的ET/PT（或HAT）作用下生成手性产物，FMNsq再生为FMNox完成黄素的催化循环。

芳烃官能团化中的区域选择性控制是合成化学中的一个经典难题。2023年，Hyster团队发现通过定向进化手段获得的突变株，可以影响底物与黄素辅因子形成的CT复合物的电性，从而调控了吲哚底物烷基化的区域选择性，最终实现了吲哚C4位置的官能团化（图15）。

1.8  其他

2023年，Poelarends团队利用BaNTR1与叶绿素光催化系统的协同作用，促进硝基苯转化成氨基苯、偶氮产物等一系列的复杂产物（图16）。值得一提的是，该反应可以在白光甚至太阳光的照射下顺利进行。另外，该文作者还发现了一种来自阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）的硝基还原酶EcNR能以硝化烯烃和硝化烷烃为起始底物合成脂肪胺。这些反应以叶绿素为光催化剂，直接利用太阳光作为能源驱动，为高价值有机化合物的合成提供了可能，也为绿色化学、节能化学领域提供了新的思路。

尽管距离2016年首次提出光敏辅因子依赖型的非天然光酶催化这一概念还不足十年，但是其在自由基介导的不对称脱卤/氢化、分子内环化、分子间C—C/C—N/C—S键的交叉耦合等众多反应类型中已有诸多报道，而且展现了多种不同的催化机理（图17），充分展示了其在不对称有机合成领域的巨大潜力。然而作为一个高速发展的新兴研究领域，非天然光酶催化也同样面对着不少的挑战：

（1）酶空腔中的自由基反应受限于诸多因素，如pH、温度、氧气敏感等，酶在其非生理条件下的活性和稳定性大打折扣。此外，酶催化反应大多在水相体系中进行，常见的有机物在水中的溶解度低。这些问题导致了反应产率不高，以及传统有机合成中的很多容易实现的反应难以在酶中进行。

（2）目前主要报道的可利用的天然光敏辅因子，例如NAD(P)H与FMN/FAD的种类有限，氧化还原电势不足，导致经常需要依赖额外的光催化剂甚至是金属光催化剂来协助反应的进行，经济成本增高。

（3）对于绝大部分光酶反应来说，其转化数（turnover number，TON）小、底物承载量低、光利用率差，目前还缺乏诸如固定化技术的支持，尚难以实现大规模的工业应用。

（4）现有光酶催化的非天然反应，自由基的引发通常依赖于脱卤/脱羧等方式，整体的原子经济性较差。另外，自由基前体往往需要额外的合成，步骤烦琐，这也极大地限制了反应底物的类型。

（5）很多光酶除了新发现的非天然反应活性外，自身还具有特定的天然催化功能，如何充分利用一种光酶的天然和非天然反应活性，实现多步串联合成复杂化合物方面仍有很大的探究空间。

（6）目前该领域的研究机理主要依靠氘代实验、密度泛函理论计算、MD模拟、X射线衍射、低温电子顺磁共振（EPR）以及光谱验证等，对催化机理的探究亟待更加深入。

（7）由于非天然光酶催化的研究仍然处于初期，各实验室方法各异且没有规范统一的标准，导致数据难以重现。随着该领域的成熟，应用范围越来越广，有必要建立光酶催化反应的技术和化学细节的标准，如光生物转化反应条件的重要信息，包括细胞密度、生理状态和形式、催化剂浓度和形式等。

近年来定向进化技术的成熟、人工光酶的发展和机器学习的兴起，也都将为非天然光酶催化的研究添砖加瓦，不断激发新的活力。为了试图解决非天然光酶催化的挑战，以下方面可能激发读者的思考：

（1）充分整合交叉学科的优势，促进光酶反应的发展。例如目前流动化学在生物医学、环境监测等方面的应用越发成熟，利用类似的技术实现光酶催化的连续自动化监测工作站具有巨大的发展潜力和应用前景；细胞工厂已经逐渐成为工业制造化学品的新风潮，将光酶反应融入细胞内，利用合成生物学的方法实现复杂的串联反应，可以为复杂化合物的生物合成提供强力支撑。

（2）目前光酶催化反应体系通常依赖昂贵的NAD(P)H作为电子供体，除此之外三乙醇胺、乙二胺四乙酸、三乙胺等缓冲液也是常见的电子牺牲供体，然而这种方法也同时面临了副产物污染的风险。开发稳定的新型光催化剂，直接高效利用水分子作为电子供体显然更加清洁环保。

（3）目前已经发现的天然光酶较少，着眼于探索更多种类的天然光酶或稀有光敏辅因子依赖型酶，以及引入更多新型的化学光敏基团，都有利于发现更多新型的光酶反应。

（4）开发更加简单高效的定向进化方法，辅以构建高通量筛选平台得以快速筛选到拥有酸碱耐受性好、有机溶剂容忍度高等优异性质的突变株，进一步通过精准调控酶的性质从而创建有效的反应元件，获得更多、更高性能的光酶催化剂 。

随着生物技术的不断发展和多学科交叉的不断推动，人们对于光酶催化非天然反应的机理逐步有了清晰认识，可以进一步促进光酶催化研究领域的深入和拓展，未来非天然光酶催化必将在有机合成尤其是绿色不对称合成领域中发挥更大的作用。

吴起，浙大化学系教授，博士生导师，浙江大学前瞻化学中心独立PI，入选浙江省万人计划科技创新领军人才。2003年获得浙江大学化学博士学位，2003-2005年在浙江大学材料科学与工程博士后流动站进行博士后研究，出站后留校任教，2008-2010年在德国马普煤炭化学研究所Manfred Reetz教授课题组做访问学者。吴起课题组主要从事生物催化、酶蛋白质工程与合成生物学研究，近5年来以（共同）通讯作者发表SCI论文30余篇，包括Angew. Chem. Int. Ed. (7篇)，Nat. Comm. (2篇)，J. Am. Chem. Soc. (1篇)，ACS Catal (3篇)，Green Chem. (2篇)等。担任SCI学术期刊Bioresources and Bioprocssing、Green Synth. Catal. 的青年编委。主持国家基金委“多层次手性物质的精准构筑”重大研究计划培育项目、面上项目等6项，“绿色生物制造”国家重点研发计划的课题1项，浙江省自然科学基金重点项目、浙江省科技厅绿色化工重大科技专项等。