合成生物学在新冠病毒广谱疫苗研发中的应用

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）自2019年底引发疫情至今，已经变异出Alpha、Beta、Delta和Omicron等不同谱系。传统疫苗的抗原序列来源于某一自然分离株的原始序列，疫苗迭代速度跟不上病毒变异的速度，导致突破性感染的发生，研发跨谱系的广谱疫苗是预防这类高变异呼吸道病毒的迫切需求。随着合成生物技术的发展，抗原的多价偶联、核心抗原模块的提取、抗原内部保守表位的工程化设计、抗原表位展示技术、计算指导的抗原重构等抗原“再设计”方案得以实现，提高了抗原的免疫原性和广谱性。合成生物学还体现在疫苗产品的生产工艺环节，基因工程表达的疫苗抗原以纳米颗粒、病毒载体、核酸、亚单位的形式，借助细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等表达平台进行规模化生产。本文综述了近年来合成生物技术在广谱疫苗（尤其是广谱新冠病毒疫苗）多种设计策略中的应用情况，总结了合成生物技术如何通过反向疫苗学的设计展示全新的共性抗原表位和交叉抗原位点，达到“以不变应万变”的广谱保护效果。本文还讨论了多种广谱疫苗设计策略的应用场景及面临的挑战。基于合成生物技术的马赛克设计策略、保守表位工程化设计策略、计算共识序列策略和新型佐剂策略，结合不同的疫苗技术路线，可提高疫苗的免疫原性、广谱保护性和安全性。这为高变异病毒的疫苗研发提供了合成生物学的新思路。

新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的持续传播造成了巨大的公共卫生问题。随着病毒不断积累突变，SARS-CoV-2已由最初的原始毒株进化出多谱系的变异毒株，新冠疫苗的开发和应用凸显了疫苗在迅速应对新发传染病方面的关键作用。尽管已有多个新冠疫苗上市，但大部分疫苗仍以SARS-CoV-2原型株为抗原，对后续出现突变株的中和能力均有不同程度的下降，即便逐年更新也追不上病毒变异速度。为了实现针对不同变异株的广谱保护效果，需进行抗原人工设计和工程化改造，合成一个具有广谱性和免疫激活能力的全新抗原。

合成生物学是结合生物学、生物工程、计算机科学和其他相关领域的原理和技术，设计、构建和改造生物系统，创造具有特定功能或特性的生物体或生物部件的学科。合成生物学的主要理念是将复杂性生物系统分解为各个更小的组件，然后重新组合实现所需的生物功能。在疫苗研发中，可将病毒蛋白模块化组合或细分成核心抗原结构域甚至每个氨基酸位点，通过工程化改造提升疫苗的免疫原性和安全性。本文对新冠广谱疫苗的现状和研发进展进行了总结，阐述了合成生物技术在广谱疫苗策略中的运用，提出了合成生物学在新冠广谱疫苗应用中面临的挑战。

1  六种疫苗技术路线及其涉及的合成生物技术

新冠病毒候选疫苗主要有六种技术路线，可以划分为三大类：第一类是将病原体培养后进行灭活或减毒处理的灭活疫苗和减毒活疫苗；第二类是在体外合成靶抗原，将其注射进人体后激活免疫反应的病毒样颗粒疫苗和亚单位疫苗；第三类是将编码病毒抗原的基因递送到宿主细胞内，在受试者体内表达靶抗原的病毒载体疫苗和核酸疫苗。表1总结了不同技术路线的SARS-CoV-2疫苗研究进展，并列出了每种疫苗的关键组分或技术。

1.1  灭活疫苗

灭活疫苗是在体外通过特殊物理或化学手段，在保持抗原颗粒完整性和抗原性的条件下将活病毒灭活，适当结合佐剂制备成的疫苗。灭活疫苗的免疫原为完全灭活的病毒粒子，不具备感染性，使用安全性高，保留了完整的病毒结构，具有良好的免疫原性。在灭活疫苗技术路线中，合成生物学概念主要体现在疫苗毒株的获得方式上。传统的疫苗株通过自然分离株的传代培养，或者与疫苗生产用鸡胚适应株重组筛选获得。随着反向遗传学技术的发展，生产用适应株的基因片段可以直接与流行株的基因片段进行体外重配，以反向遗传学技术拯救出活疫苗株，这种方法常用于流感病毒灭活疫苗种子株的拯救。由于冠状病毒反向遗传学操作的难度更大，也存在安全风险问题，目前尚未有采用反向遗传技术的冠状病毒灭活疫苗上市。表1总结并列出已上市的SARS-CoV-2灭活疫苗，均采用自然分离株培养后直接灭活。

1.2  减毒活疫苗

减毒活疫苗是由减毒或自然界分离的弱毒、无毒株制备而成，保留了病毒粒子的完整性和复制能力。减毒活疫苗可通过非侵入性递送复现病毒感染的全过程，刺激机体产生黏膜、体液和细胞免疫的多维度免疫应答。减毒活疫苗接种剂量小，接种后病毒在机体内低水平复制，可以减轻接种后的不良反应，维持免疫长效性。减毒活疫苗对储存和运输的要求较高，其弱毒性也需反复验证。在新冠病毒中，缺失病毒毒力基因（如ORF3、ORF6、ORF7和ORF8）的重组病毒在小鼠体内复制水平较低，并且可诱导更高的干扰素表达，可作为候选减毒株。此外，去除新冠病毒基因组上的修饰也能降低病毒的复制水平，删除N7-甲基转移酶（NSP14）和2′-O-甲基转移酶（NSP16）的毒株能在小鼠中获得减毒效果。目前，新冠病毒减毒疫苗由于安全性考虑尚未应用。

1.3  病毒样颗粒/纳米颗粒疫苗

病毒样颗粒（virus like particle，VLP）是由病毒衣壳蛋白、核心蛋白或包膜蛋白自组装形成的生物纳米颗粒，具有病毒天然结构，但不含基因组。VLP可在酵母、大肠杆菌、哺乳动物或杆状病毒-昆虫细胞等不同宿主中大规模表达，借助细菌或细胞的生物机制使其折叠、自组装形成与天然病毒颗粒类似的空间立体结构。VLP疫苗可模拟活病毒的感染途径，激活B细胞和T细胞反应。采用VLP技术平台研发SARS-CoV-2的疫苗相对较少，唯一一款上市的VLP疫苗是由加拿大Medicago公司研发的植物源性重组疫苗CoVLP。该疫苗设计原理是利用一种烟草植物Nicotiana benthamiana的病毒样颗粒展示三聚体形式的S蛋白，诱导较高滴度的中和抗体和持久的T细胞免疫应答，临床数据显示，CoVLP疫苗的有效性保护率为69.5%。

纳米颗粒与VLP类似，也是自组装形成纳米结构，在疫苗中主要有三种表现形式：①作为包裹抗原的载体将抗原递送至靶器官，通过调节脂质体的理化性质实现与靶细胞膜的融合；②水、油、表面活性剂等自发形成的纳米乳液抗原混合后提高抗原溶解度，达到缓释和靶向效果；③作为抗原偶联中心，在颗粒表面展示抗原。铁蛋白是最常见的非病毒自组装纳米颗粒，由24个亚基自组装形成铁内核和蛋白外壳，最高可装载24个抗原，诱导高滴度的中和抗体。除铁蛋白外，核黄素合成酶、冠状病毒非结构蛋白10和二氢硫酰乙酰转移酶也可以形成稳定的纳米颗粒，有望应用于纳米颗粒疫苗开发。

1.4  亚单位疫苗

亚单位疫苗是指借助细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等表达系统，体外表达纯化病毒特定蛋白，以病毒特定蛋白作为抗原，配伍佐剂制成的疫苗。亚单位疫苗的优势有：①安全性高，抗原来源于病毒的部分或特定结构蛋白，无感染风险；②稳定性好，抗原成分单一，有助于在生产、运输和储存过程中保持有效性；③设计性强，可对抗原进行科学设计和灵活改造，获得适配病原特征的抗原；④生产工艺清晰，抗原的表达纯化体系已相对成熟，经过条件优化可大规模表达高纯度的特定抗原；⑤免疫原性强，通常选用病毒表面膜蛋白作为抗原，具备丰富的抗原表位和保守位点，可诱导高滴度、长效、广谱中和抗体。现已有多款SARS-CoV-2亚单位疫苗上市，见表1。

1.5  病毒载体疫苗

病毒载体疫苗是将工程化的病毒作为载体，插入SARS-CoV-2抗原基因制备而成，常用的基因工程病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、慢病毒和流感病毒等。基因工程载体贴近合成生物学中的底盘生物概念，以规模化生产的、低毒性的工具病毒作为底盘，将流行毒株的抗原基因装载在工具病毒内，形成重组病毒。病毒载体在宿主中能够被免疫细胞识别，具有天然佐剂的效果，能够有效诱导宿主先天免疫反应，增强免疫细胞应答。在SARS-CoV-2疫苗研发中，常用的病毒载体为腺病毒载体和流感病毒载体，靶抗原大多选择S蛋白或RBD蛋白。厦门大学、香港大学和万泰生物联合研制的鼻喷流感病毒载体新冠疫苗（dNS1-RBD），能够在呼吸道局部诱导多维度的免疫反应，其中细胞免疫、固有免疫和训练免疫均不易受到病毒变异的影响。表1总结了已上市的病毒载体SARS-CoV-2疫苗。

1.6  核酸疫苗

核酸疫苗分为DNA疫苗和mRNA疫苗两种类型，是将编码在表达载体上或mRNA基序上的靶抗原基因序列，通过肌内注射、基因枪注射或递送系统等手段导入机体内表达靶抗原。新冠病毒核酸疫苗的抗原大多选择S蛋白或RBD蛋白，表1总结并列出已上市的新冠核酸疫苗。合成生物技术在mRNA疫苗中的应用主要体现在表达元件的优化和核苷酸修饰等方面。在mRNA的5′端添加帽子结构模拟宿主mRNA，可逃避机体先天免疫识别，保护mRNA不被外切酶降解；进行密码子优化可以提高mRNA疫苗的翻译水平；核苷酸修饰也是mRNA设计中的重要步骤，含有N1-甲基假尿苷修饰（m1Ψ）的mRNA可逃逸TLR受体识别，降低机体TNF-α的表达量，解决了mRNA易被免疫系统识别而被清除的问题，辉瑞公司和Moderna两家公司基于假尿苷修饰策略开发的新冠mRNA疫苗对新冠病毒感染保护率均高于94%。环状RNA（circRNA）疫苗也是利用合成生物技术增加mRNA稳定性的手段，利用酶促反应或自剪接内含子将mRNA环化为circRNA，以弥补mRNA稳定性差和半衰期短的劣势，相比于等效剂量的线性mRNA疫苗，含有RBD的circRNA疫苗能够诱导更有效和更持久的免疫反应，并且可在室温环境中储存两周。

2  合成生物学在抗原广谱设计中的应用

病毒的高变异特征对疫苗的广谱性和长效性提出了新的挑战，如疫苗抗原采用的是原型株序列，不论是哪种技术路线，仍然无法获得对变异株的广谱保护。因此，必须对抗原进行科学的“再设计”，增加抗原的广谱性和长效性。广谱的新冠疫苗需要具备3个特征：①由于大多数人在幼儿期会多次感染呼吸道病毒，因此，针对这些病毒的广谱疫苗必须克服抗原反应的复杂性，特别是避免以前接触过的非中和表位；②广谱疫苗要对已知毒株产生免疫应答，还必须对抗原不断变异的未知毒株产生中和反应；③广谱疫苗还需要具备高效性、长效性，以实现广谱疫苗对抗未来变异株的长期需求。

合成生物学为广谱疫苗抗原的“再设计”提供了可能性，通过模块串联、工程化改造、计算得到的免疫原经体外合成和规模化生产以及临床试验验证，可申请上市（如图1所示）。抗原的“再设计”主要包括：马赛克法、保守表位法和共识序列法。马赛克法是将包含多种突变株的核心抗原直接混合或进行模块化拼接，克隆到高效表达载体中获得可覆盖多种突变株的混合抗原。以马赛克法设计的抗原通常需要结合纳米载体、抗原串联、二聚体化等展示手段才能发挥最佳效果。保守表位法是将病毒膜蛋白的保守区域作为免疫原，但这些区域在体外往往不稳定，需要对结构进行重构和工程化改造才能得到稳定的蛋白质，以保守表位法设计的亚单位疫苗可以抵御病毒变异对疫苗效果的影响。共识序列法是通过计算病毒的进化方向，将相同进化分支的病毒序列聚类到一起，得到一条共识序列（含有该分支中频率最高的共识性的位点），再将不同分支的共识序列计算得到总共识序列。以共识序列作为氨基酸模板，需要设计最佳的密码子优化方案，再将优化后的核酸在体外表达系统中表达出蛋白质。共识序列疫苗可在保留抗原天然完整结构的情况下，覆盖病毒适应性变异的共性位点，对未来突变株具有很强的预见性。下文将详述3种广谱疫苗抗原设计策略及其中的合成生物学技术。

2.1  马赛克策略

马赛克策略借用了传统“多价疫苗”的概念，将新冠病毒不同突变株的核心抗原视为不同元件，在高表达的载体底盘上模块化装载元件，分别组建单体、二聚体和多聚体等元件串联形式，结合纳米展示技术、结构生物学手段筛选稳定的广谱抗原。该策略的优势在于将多个流行突变株的抗原组合到一个疫苗中，获得比原始毒株或单价突变株的疫苗更丰富的抗原表位，诱导产生针对多种突变株的中和抗体，提升疫苗的广谱性。马赛克策略还能根据流行株变化情况快速替换疫苗抗原，可实现抗原的快速迭代，拓展疫苗对新发突变株的保护能力。利用冠状病毒S蛋白RBD结构域组装而成的二聚体疫苗，通过将原型株RBD替换为Omicron BA.1和BA.2 RBD的异源二聚体组合，相比原型株疫苗获得了对Omicron突变株更佳的保护效果。表2中总结了采用马赛克策略的新冠疫苗。尽管马赛克策略具有实用性和快速构建的特点，但冠状病毒和流感病毒变异快、亚型众多，此策略无法实现对更多突变株的无限加和，价次提高对抗原的表达纯化也带来很大的难度。由于只能在已经出现的突变株上增加价次，该策略也缺乏对未来突变株的保护能力。

2.2  病毒保守表位策略

病毒保守表位策略体现了“以不变应万变”的疫苗设计理念，此策略以病毒不易突变的保守区域为抗原，不受变异株的影响，能对不同变异株中恒定不变的抗原区域产生保守的免疫保护效应。新冠病毒S蛋白由S1和S2两个亚基组成，S1亚基与宿主细胞表面受体结合，介导病毒入侵，包括NTD和RBD两个区域。相比于RBD，NTD变异率低，是S1中的保守表位。S2亚基可促进病毒膜与宿主细胞膜融合，包含七肽重复区（heptad repeat，HR）HR1和HR2。HR1和HR2紧密结合形成六螺旋构象，介导病毒与宿主细胞的膜融合，在Sarbecovirus中保守性均高达90%。以保守的HR1和HR2形成的融合中间态为抗原，可诱导机体产生抑制病毒膜融合的抗体（图2）。但保守表位通常较短、免疫原性弱，无法在体外高表达，需要工程化改造。为了提高HR1、HR2抗原的免疫原性和表达水平，研究者开发了多种抗原改造策略。Pang等将HR1和HR2拆解为元件，通过异构HR1和HR2形成重组蛋白HR121（HR1-linker1-HR2-linker2-HR1），还原S2亚基融合中间态的构象和功能[图3(a)]，接种HR121的叙利亚黄金仓鼠获得了抵抗原型株和Omicron BA.2感染的能力。另一种策略是将S2亚基的HR1、CH和SH三个功能区反向平行排列构建重组蛋白HR1LS，还原HR1融合中间态的三聚体构象，暴露HR1与HR2结合的疏水槽[图3(b)]。在病毒感染时，HR1LS通过竞争性结合S2亚基的HR2区域抑制膜融合过程，因此，HR1LS既可作为抑制剂，也可作为免疫原使用。当HR1LS作为抑制剂时，可产生对Delta、Omicron突变株假病毒和HCoV-OC43活病毒感染的高效抑制活性；当HR1LS作为免疫原时，可诱导小鼠产生针对SARS-CoV-2和其他HCoVs的交叉中和抗体反应。HIV-1、流感病毒与新冠病毒的外膜蛋白都是Ⅰ型膜蛋白，膜融合机制相似，均可通过模拟融合中间态的保守表位合成免疫原。表3中总结并列出采用靶向SARS-CoV-2保守表位策略的疫苗研究进展。

2.3  共识序列设计策略

病毒作为寄生生物，是向着更加适应宿主的方向变异的。因此，利用病毒进化遗传学研究手段，可以计算得到病毒定向进化的共识性位点。这些共识性位点是所有进化分支上病毒的趋同变异位点或保守位点，含有这些共识性位点的全长抗原序列称为共识序列。共识序列设计的底层逻辑是病毒进化的方向性，将基因型具有相似亲缘关系的变异株序列聚类为同一系统分支，计算每一分支的代表性毒株序列，最终获得能够位于进化中心、具有共识性的抗原蛋白序列，如图4所示。共识序列代表的是病毒进化的共性和趋同性，可以覆盖未来毒株的变异位点，延长疫苗的保护周期。共识序列的设计首先需要计算病毒序列的进化关系和进化树，需要预先建立一个完整、多样的病毒序列数据库。新冠病毒和流感病毒这类高变异呼吸道病毒都有开源的、持续监测和更新毒株序列的全球数据库共享机制，使得这类病毒的共识序列计算方法成为可能。在疫情爆发初期，病毒变异尚未形成丰富的多样性时，计算出来的共识序列可能对未来变异株的代表性仍然不足。当呼吸道病毒在人群中完成定殖时，突变方向逐渐固定，这时计算得到的共识序列就更有代表性和准确性。当病毒发生跨种传播导致抗原完全变异成新的亚型时，共识序列也需要重新计算或多个共识序列进行组合。

共识序列设计策略已应用于包括新冠病毒在内的多种病毒广谱疫苗设计中。以甲型H5N1流感病毒HA蛋白共识序列为抗原的疫苗可产生针对clade 1、clade 2.1、clade 2.2、clade 2.3.2和clade 2.3.4亚类的H5N1高致病性毒株的中和抗体和免疫保护。以H3N2流感病毒HA蛋白共识序列设计的DNA疫苗，可保护小鼠免受多种H3N2毒株的感染。本课题组前期设计的甲型H1N1流感病毒HA蛋白共识序列抗原也可诱导机体对不同进化分支上H1N1病毒产生广泛的T细胞和B细胞免疫反应。在新冠病毒方面，通过分析NCBI数据库中的2675条新冠病毒S蛋白序列，计算所有突变位点发生频率，找到了位于新冠病毒进化中点的共识序列Span。相比原型株免疫原，以Span作为抗原的疫苗具有更明显的广谱中和优势，无论常规的primer-boost接种策略还是作为加强针，均可诱导针对多种变异株的中和抗体，提供跨谱系的交叉免疫保护。共识序列设计的Span免疫原对其后出现的新冠Delta和Omicron突变株同样具有保护效果，表明共识序列抗原具有覆盖未来突变株的能力。

2.4  多种抗原设计策略的比较与应用

马赛克设计策略从“多价混合”角度出发，选择关键毒株的抗原表位或突变位点，增加突变毒株的覆盖范围，但马赛克策略选择的抗原来自现有突变株且由设计者主观选择，难以实现对所有突变株的“大广谱”保护。保守表位设计策略则从“保守”角度出发，找到病毒关键蛋白的保守表位，借助抗原反向设计和合成生物技术，获得“保守抗原”。保守表位疫苗具有对同一家族病毒“大广谱”的保护能力，但由于保守表位往往针对病毒膜蛋白的茎秆区或病毒内部蛋白，诱导的抗体中和活性不如针对头部抗原的抗体活性强。共识序列设计策略从“追踪进化方向-覆盖趋同突变”的角度出发，计算获得位于进化中点的“共识序列”。共识序列由每个位置上出现最高频率的氨基酸组成，可最大程度实现对所有进化分支的覆盖。由于共识序列抗原的设计过程遵循病毒进化规律，排除了主观因素影响，对未来出现的突变株也具有一定的预见性。当病毒亚型间进化距离过远（例如流感病毒H1和H3亚型），共识序列策略也无法通过一条序列覆盖所有进化分支，需要分别计算不同亚型的共识序列并进行组合。上述多种抗原设计策略需在不同阶段运用，发挥不同策略的优势。在疫情流行初期可采用马赛克策略快速迭代；随着病毒的长期流行和变异，数据库逐渐丰富后，可采用保守表位和共识序列策略。

3  合成生物学在新型佐剂策略中的应用

除抗原设计外，还可以使用强效佐剂增加疫苗的广谱性。SARS-CoV-2新型佐剂疫苗策略是指在原型株疫苗的基础上加入新型高效佐剂联合使用，从而使原型株疫苗诱导出高效的广谱中和抗体。新型佐剂可分为分子内佐剂和分子外佐剂。

分子内佐剂是在抗原分子内融合表达抗体骨架或免疫激活蛋白，通过融合表达的分子内佐剂，促进抗原的提呈，延长抗原半衰期或激活免疫细胞。例如，以IgG Fc片段为支架，将新冠RBD蛋白串联形成的多聚体RBD-Fc蛋白，相比RBD单体蛋白，其能诱导更高效、长期的中和抗体反应。此外，Sun等在RBD-Fc的RBD蛋白N端添加IFN-α蛋白为分子内佐剂，增强了将RBD-Fc靶向递送至抗原提呈细胞的能力，此方法制备的抗原在低剂量或在没有其他佐剂的情况下也具有较高的免疫原性。

分子外佐剂是在抗原分子外单独表达免疫增强剂或纳米载体，与抗原预混后制备成苗，通过激活抗原提呈细胞或促进炎症反应等方式增强机体免疫反应。常见的分子外佐剂包括铝盐、油乳剂、天然或合成的多糖类物质等，随着合成生物技术的发展，出现了多种新型分子外佐剂。Liu等研究发现，基于STING激动剂cGAMP设计的肺部仿生纳米颗粒CF501可作为广谱疫苗的黏膜分子外佐剂，诱导针对Sarbecovirus亚属冠状病毒的高滴度交叉中和抗体反应以及T细胞免疫应答。这种肺部仿生纳米颗粒（PS-GAMP）佐剂在不破坏肺部表面活性和肺泡上皮屏障情况下，激活肺泡细胞中STING信号通路，促进流感疫苗产生高效的细胞免疫和体液免疫应答，可抵抗多亚型流感病毒感染，有望作为“通用”流感疫苗黏膜佐剂。表4中总结并列出采用新型佐剂策略的疫苗研究进展。新型佐剂在扩大人群接种范围时需持续观察副反应。

4  合成生物学在疫苗生产工艺优化中的应用

合成生物学技术推动了广谱疫苗的工业化进程，主要体现在生产工艺中提升表达元件和表达基质的效率，包括：①改造表达载体，插入性能更强的基因调控表达元件，可降低杂蛋白表达量，提高抗原蛋白表达纯度；②改造目的抗原元件，优化抗原密码子，提高抗原蛋白表达量和活性；③改造表达基质，使用基因编辑构建高效表达抗原的工程菌或细胞工厂，提高抗原蛋白的产能；④改造抗原病毒载体，递送抗原至靶细胞，诱导多维度免疫应答；⑤修饰抗原mRNA，改造抗原mRNA，添加核苷酸修饰，逃逸机体免疫识别，提高抗原蛋白翻译效率。随着合成生物技术的广泛应用，抗原表达系统逐步规模化和产业化。但不同类型抗原的纯化和放大工艺需要定制，尚缺少统一标准，如何避免表达介质的蛋白残留也是值得关注的安全性风险。

5  合成生物学在新冠广谱疫苗研发中面临的挑战

新冠疫苗研发速度飞快，几年时间已经研发出多达百款SARS-CoV-2候选疫苗。但一款好的疫苗必须同时具备高效、持久、广谱和安全等特征，因此如何利用合成生物技术开发出安全高效的SARS-CoV-2疫苗仍然存在挑战。

5.1  突破性感染的挑战

自2019年末起，新冠病毒已在人群中传播数年，病毒积累了大量突变，进化出多种突变株。Alpha株和Delta株获得了D614G突变，其感染性相较原型株提升3倍以上。Beta和Gamma株获得了E484K突变，其对原型株疫苗的免疫逃逸能力分别提升4.5倍和34.5倍。而Omicron株及其亚型的Spike蛋白则积累了更多的突变（33个以上），使Spike的免疫原性发生较大改变，原型株疫苗对Omicron突变株的中和抗体滴度下降至原来的1/40。在原型株疫苗逐渐失效的背景下，急需结合疫苗抗原反向设计与合成生物学理念，通过科学设计抗原提升疫苗的广谱性和持久性，以解决突变株突破性感染问题。

5.2  疫苗效果评价的挑战

评价新冠疫苗保护效果的两个重要指标分别是预防感染效率和预防重症效率，国内外对这两个指标的定义是一致的。疫苗接种后接种者如出现新冠核酸诊断阳性或抗原阳性定义为感染，疫苗接种后接种者仍出现《新冠肺炎诊疗方案》中重症症状则定义为重症。我国两款灭活疫苗WIBP和BBIBP-CorV预防感染的效率分别为72.8%和78.1%，预防重症效率均为100%。辉瑞公司mRNA疫苗BNT162b2预防感染的效率高达95%，预防重症效率为96.7%。疫苗诱导的中和抗体滴度也是评价疫苗保护效果的另一个指标，据报道，接种第二针WIBP或BBIBP-CorV灭活疫苗2周后的中和抗体的几何平均滴度（geometric mean titer，GMT）分别为94.5和156.0，低于56~85岁人群接种BNT162b2的GMT值（GMT=255.0）。由于mRNA疫苗使用的是新冠病毒的S抗原，而不是全病毒，可能有利于针对S蛋白产生抗体，排除其他病毒蛋白的干扰。以病毒外膜蛋白作为免疫原的核酸疫苗和亚单位疫苗都可以通过抗原的“再设计”进一步增加免疫原性和广谱性，或者将靶抗原装载至工程化病毒载体，通过鼻喷等接种途径激活呼吸道黏膜免疫，有利于阻断病毒在呼吸道部位的感染。因此，不同类型疫苗接种后的效果评价因疫苗免疫原特性、接种途径不同会存在差异，如何建立一套标准化的多维度指标针对不同技术路线的疫苗进行公平的评价仍存在挑战。

5.3  动物模型的挑战

开发出能够反映COVID-19患者疾病发生进程和严重程度的动物模型对疫苗评价极为关键。冠状病毒研究领域中的小型动物模型包括小鼠、仓鼠、雪貂等。SARS-CoV-2不能利用野生型小鼠ACE2受体入侵，研究人员开发了多种遗传背景的hACE2基因编辑小鼠建立SARS-CoV-2感染模型，但此种小鼠的感染症状仍与人体有较大差距。雪貂ACE2与人类ACE2同源性高，与S蛋白结合区域结构相似，无需基因编辑即可支持SARS-CoV-2的感染。雪貂模型相对基因编辑小鼠模型的优势是具备空气传播途径，可用于评价疫苗控制病毒传播的效果，是SARS-CoV-2疫苗研发评价中最具有潜力的动物模型，但雪貂的饲养较为困难，高昂的价格也限制了该模型的广泛应用。非人灵长类动物实验模型（non-human primates，NHP）与人类最为接近，常被用于疫苗评价的NHP包括恒河猴和食蟹猴，但该动物模型常受限于生物安全三级实验室配套设施和成本等因素的制约。

5.4  安全性挑战

由于新冠疫情的急迫性，多款上市新冠疫苗是紧急获批使用。研发机构常常在较小样本群体中进行短期安全性临床实验，因此很多副反应只能在上市后观察。随着疫苗的大规模接种，疫苗的各种不良反应开始出现。有研究报道，部分人群接种mRNA-1273和BNT162b2两种mRNA疫苗后，产生了过敏性休克、面瘫和急性心肌炎等不良反应，表明mRNA疫苗的安全性仍需持续关注。最近的一项研究发现，辉瑞和Moderna的COVID-19疫苗中使用的假尿苷修饰mRNA容易诱发密码子读码错误。此外，接种腺病毒载体疫苗Ad26-CoV2-S的部分人群出现格林-巴利综合征和血栓等症状的风险增加。在合成生物技术的深度参与下，反向疫苗学可以精确地进行疫苗设计，有利于进一步去除上述致病因素的干扰，最大程度减少潜在的不良反应问题。

合成生物学在新冠病毒广谱疫苗的研发中具有广泛的应用潜力，在设计广谱抗原、开发新型佐剂、优化疫苗生产工艺等环节中应用合成生物技术将有助于提高疫苗的免疫原性、广谱性和长效性，丰富高变异病毒疫苗的研发手段。同时，合成生物技术应用于广谱疫苗研发仍有较大的提升空间，在未来更合理地将合成生物学与反向疫苗学等多学科技术交叉融合，解决新冠广谱疫苗研发中面临的突破性感染、疫苗效果评价、动物模型、安全性等挑战，有望建立更完善的广谱疫苗开发模式，促成更好的广谱疫苗的诞生。

徐可，武汉大学生命科学学院教授，博士生导师。担任中国生物工程学会理事、湖北省生物工程学会理事、国家病原微生物实验室生物安全评审专家委员，Viruses、 Archives of Virology、 Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 等期刊编委。入选欧洲流感病毒学会青年科学家计划、湖北省杰出青年人才、上海市启明星人才、牛顿基金青年人才、赛诺菲-安万特青年人才、中国科协强国青年科学家提名奖等。作为项目负责人近年主持十四五国家重点研发计划项目、国家自然科学基金重点专项、国家自然科学基金优秀青年项目等20余项。在Nature、 Science Translational Medicine、 Cell Research、 Nature Communications 等期刊发表文章40余篇，他引3300余次。研究方向为呼吸道RNA病毒分子致病机制、抗呼吸道RNA病毒广谱药物靶标发现和广谱疫苗研发。

E-mail: xuke03@whu.edu.cn