基于重组人Ⅲ型胶原蛋白的三聚体抗原疫苗策略在新冠和流感疫苗中的应用

新冠病毒等多种包膜病毒的糖蛋白在天然状态下呈现三聚体形式。三聚体蛋白通常较单体蛋白具有更优的免疫原性。目前使用非人蛋白来源的Foldon等三聚体基序可促使目的蛋白形成稳定三聚体，但这些基序的强免疫原性会削弱目的蛋白的免疫应答，限制了其在疫苗抗原设计中的应用。在本研究中，发现并利用重组人源化Ⅲ型胶原蛋白（Rh3C）作为新型三聚体基序，利用合成生物学方法，与新冠病毒刺头（spike）蛋白受体结合域（RBD）融合表达后促使RBD形成三聚体。这种胶原-RBD（Rh3C-RBD）三聚体蛋白在免疫小鼠后，较RBD单体蛋白诱导产生了更高滴度的结合抗体和中和抗体。此外，我们还进一步验证了该Rh3C基序与流感病毒HA1蛋白融合后，较HA1单体蛋白可在小鼠体内诱导更强效的抗体应答。因此，这种新型的Rh3C基序，有望广泛用于三聚体疫苗抗原的设计和优化。

新冠病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2）和流感病毒（influenza virus）等呼吸道病毒持续威胁人类健康。提高疫苗抗原的免疫原性，诱导强效的免疫应答，对于开发新冠疫苗和流感疫苗至关重要。新冠病毒的刺突（spike，S）蛋白包含S1和S2两个亚基。S1亚基包含受体结合域（receptor-binding domain，RBD）负责识别宿主细胞的受体。S2亚基负责介导病毒膜与宿主细胞膜融合。新冠病毒的S蛋白，特别是其上的RBD结构域抗原区，是开发疫苗的主要抗原靶点之一。在天然情况下，新冠病毒的S/RBD蛋白呈现同源三聚体的形式。目前有较多研究证明S三聚体与RBD三聚体较S单体与RBD单体具有更好的免疫原性，可在机体中诱导更高滴度的中和抗体。与此类似，流感病毒的糖蛋白HA也包含HA1和HA2两个亚基，分别负责介导病毒与受体的识别和病毒膜与靶细胞膜的融合，是疫苗抗原设计的主要靶点。HA在天然情况下也同样为同源三聚体结构。因此，设计新冠病毒/流感病毒的三聚体疫苗抗原，对于提升疫苗效果具有重要意义。

目前人们已经开发了一些具有三聚体结构特征的蛋白基序，例如Foldon基序。Foldon是T4噬菌体次要纤维蛋白（fibrin）的C末端区域，其可自发形成典型的三聚体。Foldon亚基内部通过非共价键作用共同维持稳定结构，三聚体稳定性高，目前已在1型艾滋病病毒（HIV-1）gp140、SARS-CoV-2 RBD等三聚体蛋白上用作三聚体标签基序。然而，虽然Foldon可有效促使目的蛋白呈现三聚体形式，但其分子量较大，具有强免疫原性。将Foldon和病毒蛋白的融合三聚体抗原免疫人体后会产生对Foldon蛋白的强烈免疫应答，削弱了对病毒蛋白的抗原反应。因此仍需开发其他的三聚体策略用于疫苗抗原的设计。

合成生物学技术在近年来迅速发展，并在许多领域展示出巨大的应用价值。人们通过集合基因工程、分子生物学、结构生物学等手段，可以精确设计和合成具有特定结构和功能的蛋白质，比如重组人源化胶原蛋白。胶原蛋白在人体中含量丰富，参与形成皮肤、骨头、韧带、角膜等组织。在人体中，至少有28种类型的胶原蛋白。其中Ⅲ型胶原蛋白广泛分布于皮肤、血管等组织。在前期研究中，我们发现了人Ⅲ型胶原蛋白三螺旋区中一个重要的功能区（Gly483-Pro512）并解析了其主要区域的晶体结构，发现该功能区能折叠成典型的三股螺旋结构，具有强效的细胞黏附特性。随后，我们进一步设计和表达了该功能区16重复串联的融合蛋白-重组人源化Ⅲ型胶原蛋白（Rh3C），发现Rh3C具有更强的细胞黏附特性，提示了其具有更加稳定的三螺旋构象。由于Ⅲ型胶原蛋白广泛分布于人体中，较难在人体中产生免疫应答，且可有效形成三聚体，故而在本文中，我们将SARS-CoV-2的RBD蛋白与该Rh3C基序连接后进行融合表达，发现该融合蛋白（Rh3C-RBD）可形成三聚体构象。小鼠免疫后发现，Rh3C-RBD三聚体Rh3C较RBD单体蛋白可更加强效地诱导RBD特异性结合抗体和中和抗体。此外，我们也进一步在流感HA1抗原中验证了该策略，发现与该重组胶原融合后的HA1蛋白在小鼠体内较单体形式的HA1也可诱导较高的IgG抗体水平。因此，以上结果提示这种新型的Rh3C基序，有望广泛用于三聚体疫苗抗原的设计和优化。

1  材料与方法

1.1  实验材料

EXPi293悬浮细胞、Huh-7细胞、HEK293T细胞，EasyTrans转染试剂，HRP标记的兔抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a二抗，Luciferase检测试剂盒。

1.2  蛋白的表达与纯化

将Rh3C（GERGAPGFRGPAGPNGIPGEKGPA GERGAP₁₆）通过Linker（GAPGPCCGG-GGGGS₄）分别与SARS-CoV-2（Delta）RBD（Arg319-Asn532）或者H1N1（WSN）的HA1（Asp18-Arg343）的基因序列进行连接，并在C末端加入6个组氨酸，在南京金斯瑞生物进行基因合成。然后将合成后的序列分别利用ECOR Ⅰ和NCO Ⅰ酶切位点插入到pFUSE-hIgG₁-Fc2载体。分别命名为Rh3C-RBD和Rh3C-HA1质粒。然后利用EXPi293真核表达系统分别对这两种蛋白进行表达。具体方法参照Liu等的方法。首先当EXPi293悬浮细胞密度为2×10⁶时，利用EasyTrans（李记生物，上海）转染试剂对质粒进行转染。转染6天后，收集细胞上清，过0.45 μm的滤膜后，进行蛋白纯化。通过NI-NTA亲和色谱对蛋白进行纯化。首先将收集的细胞上清与NI-NTA在4 ℃孵育2 h后，利用10 mmol/L的咪唑进行杂蛋白的洗涤。最后利用500 mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白。将洗脱的目的蛋白进行超滤浓缩后，利用SDS-PAGE鉴定蛋白的分子量和纯度。

1.3  蛋白分子量大小的鉴定

应用凝胶过滤色谱，使用Superose 6 increase 10/300凝胶柱在GE蛋白色谱纯化系统AKATA中分别上样纯化后的Rh3C-RBD蛋白和标准品蛋白。根据标准品蛋白分子量测算Rh3C-RBD 蛋白分子量大小。此外，利用粒径分析仪Zetasizer Nano System，根据操作说明，测量Rh3C-RBD蛋白分子量大小。

1.4  小鼠免疫

Balb/c小鼠购自北京维通利华有限公司。小鼠的性别为雌性，8周龄。小鼠免疫采用肌内注射方式。每组小鼠共6只，分别免疫5 μg的Rh3C-RBD/Rh3C-HA1和20 μg的CF501；5 μg的RBD/HA1和20 μg的CF501；5 μg的Rh3C-RBD/Rh3C-HA1和等体积的铝佐剂（Thermo Scientific）；5 μg的RBD/HA1和等体积的铝佐剂（Thermo Scientific）。小鼠共免疫两次，间隔14天。在第21天采集小鼠血清，存放于–20 ℃。

1.5  ELISA

参考Liu等的方法进行ELISA实验。分别将1 μg/mL的RBD或HA1包被于ELISA板中，在4 ℃过夜包被。然后加入100 μL的含5% BSA的PBST，于37 ℃封闭2 h。将小鼠血清利用PBST进行系列倍比稀释后，加入到ELISA板中，于37 ℃孵育1 h。利用PBST进行洗涤5次后，分别加入HRP标记的兔抗小鼠的IgG、IgG1和IgG2a二抗。于37 ℃孵育1 h后，利用PBST洗涤5次。加入TMB底物显色，然后加入H₂SO₄进行终止。利用酶标仪检测ELISA板中每孔的A450数值。

1.6  SARS-CoV-2假病毒的制备

SARS-CoV-2假病毒的制备参考Liu等的方法。将生长良好的HEK293T细胞进行传代。24 h后，待细胞密度在60%~80%时，利用Vigofect转染试剂对PNL-4-3骨架质粒和PcDNA-3.1-SARS-CoV-2-S质粒进行共转染。8 h后更换新鲜DMEM培养基。48 h后收取细胞上清即为SARS-CoV-2假病毒。SARS-CoV-2假病毒存放于–80 ℃。

1.7  假病毒中和实验

将生长良好的Huh-7细胞铺96孔板，每孔5000个细胞。8 h后，对小鼠血清进行系列倍比稀释，然后加入等体积的SARS-CoV-2假病毒，于37 ℃孵育0.5 h。将血清和假病毒混合液加入到Huh-7细胞中。在12 h后，更换新鲜的DMEM培养基。继续培养48 h后。加入细胞裂解液作用0.5 h。然后加入Luciferase底物。检测Luciferase活性。

1.8  统计学分析

结果以平均值±标准误差表示。使用GraphPad Prism分别利用One way ANOWA、Student-t test、Two way ANOWA对实验数据进行统计学分析。

2  结 果

2.1  基于重组人源化Ⅲ型胶原蛋白（Rh3C）基序的SARS-CoV-2 RBD三聚体蛋白的设计、表达与鉴定

前期研究中，筛选获得了人源化Ⅲ型胶原蛋白Gly483-Pro512功能区，并通过将该区域进行16重复的串联表达获得性质更好的Rh3C。本研究将Rh3C通过Linker与SARS-CoV-2的RBD蛋白以融合蛋白的形式表达（Rh3C-RBD），期望在胶原蛋白三聚化的作用下促使RBD以三聚体的形式表达，提高RBD的免疫原性[图1(a)]。利用AlphaFold2程序，预测了Rh3C-RBD融合蛋白的三聚体结构[图1(b)]。结果显示，整个Rh3C-RBD分子可以形成规则的三聚体结构，长度大约140 nm。分子的前端为相互错位1个氨基酸的胶原三聚体结构，后端为3重中心轴对称的RBD三聚体结构，两个结构由柔性Linker连接。该分子整体结构与设计预期基本吻合[图1(c)]。接下来的实验结果显示，Rh3C-RBD蛋白可被高效重组表达[图1(d)]。SDS-PAGE呈现的Rh3C-RBD蛋白单体分子量与预期蛋白分子量一致，约为85 kDa左右。通过对该蛋白进行纯化，获得了高纯度的Rh3C-RBD蛋白。通过凝胶过滤色谱检测了所表达的Rh3C-RBD的分子量，约为274 kDa，为所预测分子量的3倍左右，提示了Rh3C-RBD以三聚体形式成功被表达[图1(e)]。进一步通过测量该蛋白的粒径，估算出了该蛋白在天然情况下的分子量大小，约为255 kDa[图1(f)]，与凝胶过滤色谱结果一致，符合预期的三聚体分子量。结果提示，Rh3C-RBD以三聚体的形式被表达及制备。

2.2  Rh3C-RBD三聚体和RBD单体免疫原性的比较

为了鉴定Rh3C-RBD三聚体是否比RBD单体具有更好的免疫原性，利用之前研发的新型STING激动剂CF501和铝佐剂（Thermo）分别作为Rh3C-RBD三聚体和RBD单体的佐剂免疫Balb/c小鼠。在免疫两次后，对小鼠血清中的RBD特异性抗体进行检测。结果如图2所示。CF501佐剂组，Rh3C-RBD在小鼠体内所诱导产生的RBD特异性IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平显著高于RBD单体蛋白诱导的抗体水平。CF501/Rh3C-RBD组小鼠血清针对RBD的特异性IgG平均抗体滴度为656 100，较CF501/RBD组小鼠血清的IgG抗体水平高约27倍（P<0.0001）Alum/Rh3C-RBD组小鼠血清针对RBD的特异性IgG平均抗体滴度为5467，较Alum/RBD组小鼠血清的IgG抗体水平高约4倍。同样CF501/Rh3C-RBD组小鼠所诱导的RBD特异性IgG1和IgG2a的抗体滴度分别为1 433 600和307 200，高出CF501/RBD组小鼠血清中抗体滴度14倍（P=0.0069）和53倍（P<0.0001）。这些数据提示了，融合Rh3C后的RBD三聚体较RBD单体可在小鼠体内诱导更加强效的特异性抗体免疫应答。

2.3  Rh3C-RBD三聚体和RBD单体抗原在小鼠体内诱导的中和抗体评价

为了进一步鉴定Rh3C-RBD三聚体是否会诱导更高的中和抗体水平，将SARS-CoV-2（D614G）的刺突蛋白表达在HIV骨架蛋白表面，构建了SARS-CoV-2的假病毒。并利用SARS-CoV-2（D614G）和Omicron（BA.2.2）假病毒系统检测小鼠血清中的中和抗体效价。结果如图3所示，CF501/Rh3C-RBD组小鼠血清中对D614G和BA.2.2假病毒的平均中和抗体效价为3620和2807，而CF501/RBD组小鼠的平均效价仅为191和64。同样地，Alum/Rh3C-RBD组小鼠血清对D614G假病毒的平均中和抗体效价为198，而Alum/RBD组小鼠血清的平均中和抗体效价仅为63。Alum/Rh3C-RBD和Alum/RBD组小鼠血清对BA.2.2假病毒都未产生强效的中和作用。以上数据提示了，Rh3C-RBD不仅可显著提高抗原特异性结合抗体，还可以有效增强中和抗体的免疫应答。

2.4  Rh3C三聚体策略在流感病毒抗原设计中的应用

为了评价该Rh3C是否可作为一种增加抗原免疫原性的通用元件，进一步将该Rh3C与流感病毒H1N1 HA1蛋白进行融合表达[图4(a)]。经过SDS-PAGE鉴定后，发现Rh3C-HA1成功被表达，并具有较高的纯度[图4(b)]。进一步将Rh3C-HA1和HA1分别与佐剂CF501或Alum联用免疫Balb/c小鼠[图4(c)]。免疫两次后利用ELISA检测HA1特异性的IgG抗体水平。结果如图4(d)、(e)所示。无论是利用CF501佐剂还是铝佐剂，Rh3C-HA1所诱导的HA1特异性IgG抗体滴度要显著性地高于HA1抗原诱导的IgG抗体水平。该结果提示，Rh3C三聚化策略不仅可提高SARS-CoV-2 RBD抗原诱发特异性结合抗体和中和抗体，还可提高流感HA1诱发的特异性结合抗体。有望成为一种通用的增强抗原免疫原性的三聚化策略。

Ⅰ型包膜病毒的糖蛋白在天然状态大多以三聚体形式呈现，例如HIV-1 Env蛋白、流感病毒HA蛋白、新冠病毒S蛋白和呼吸道合胞病毒F蛋白等。制备和天然状态相近的三聚体抗原对于研发这些疫苗至关重要。目前应用最为普遍的是利用Foldon作为三聚化基序与目的蛋白融合表达，获得三聚体构象蛋白。融合Foldon的三聚体蛋白虽然也可显著提高目的蛋白的免疫原性，但机体中会产生对Foldon本身的大量抗体，削弱了对目的蛋白的免疫应答。Rh3C基序蛋白在免疫小鼠后，在小鼠体内可能会诱发对该Rh3C本身的抗体。Rh3C来自于全人源Ⅲ型胶原蛋白的部分片段，Ⅲ型胶原蛋白广泛存在于人体各组织器官中，具有安全无毒、免疫原性低等特征。由于T细胞和B细胞在发育过程中需经历阳性选择和阴性选择，存在中枢和外周免疫耐受机制，因此来自于人Ⅲ型胶原蛋白功能区天然序列的三聚化基序，较难在人体中产生特异性抗体。即使与佐剂配伍使用，引起针对自身胶原蛋白的抗体可能性也较低。因此融合Rh3C的抗原可让免疫应答更加聚焦目的蛋白。此外，该Rh3C可作为三聚化基序促使与之融合表达的目的蛋白呈现三聚体形式，增加目的蛋白的免疫原性。同时，该Rh3C三聚体策略具有通用性，可促使多种抗原形成三聚体。

新冠病毒的RBD单体蛋白免疫原性较差，通过利用多种策略将RBD构建成二聚体或三聚体可显著提高其免疫原性。例如通过串联表达的方式构建的RBD二聚体较RBD单体可显著诱导免疫应答；将RBD同人IgG1 Fc融合表达后可获得RBD-Fc二聚体蛋白，除增加RBD免疫原性外，Fc还可发挥分子内佐剂的作用；将RBD同Foldon融合表达形成稳定的三聚体也可显著增强抗体免疫应答。本文所构建的Rh3C蛋白优势在于提供了一种来自于人Ⅲ型胶原蛋白片段的三聚体基序，在生物相容性和安全性等方面可能更具有优势。

如今，合成生物技术在当前科学研究和应用中扮演着越来越重要的角色。该技术的重要性在于提供了一种精确、可控的方法来设计和构建新的生物分子，从而实现对生物分子及生物体的精确操控和优化。例如，本研究中利用的基于合成生物技术设计的Rh3C，已被发现具有良好的生物学性能和广泛的应用场景，包括治疗阴道萎缩、心血管支架涂层、快速修复慢性糖尿病伤口感染、抗炎与血管生成、改善盆底功能障碍、缓解皮肤光老化、改善慢性子宫内膜炎等。本研究利用基于合成生物技术设计的Rh3C基序，为三聚体疫苗抗原的设计和优化提供了新的思路和方法。目前所设计、表达和制备的Rh3C-RBD和Rh3C-HA1抗原蛋白，初步证明了较未融合该Rh3C基序的RBD或HA1抗原，在小鼠模型上诱导产生了更加强效的体液免疫应答。这显示了合成生物学技术的应用潜力，为各类病毒的三聚化抗原设计提供了一种有效的、普适的新型抗原设计策略。后续我们还将深入分析这类抗原蛋白的精细结构特征，并在灵长类动物模型中证明该类融合蛋白的免疫原性，包括评估针对胶原基序产生抗体的情况。同时，也还将设计开发更多种类和特性的该类基序蛋白，进一步提高疫苗的免疫原性和保护效果，为解决人类面临的越来越严峻的病原微生物挑战提供新的解决方案。

姜世勃，复旦大学基础医学院、上海市重大传染病和生物安全研究院教授，病原微生物研究所所长，美国微生物科学院院士。主要从事抗病毒药物和疫苗的研究。在Cell（3篇）、Nature（2篇）、Science（2篇）、The Lancet（4篇）、CNS子刊（92篇）等SCI杂志发表584篇科学论文（总影响因子7245，篇均IF12.4；总被引47 572次，篇均被引81次），h指数为107；连续8年入选爱斯唯尔的“中国高被引学者”榜单，连续3年入选科睿唯安的“全球高被引科学家”榜单。曾担任The Lancet 的编辑顾问，现担任Antiviral Res 和Emerging Microbes & Infections 等8个SCI杂志的编委。申请发明专利115项，获授权56项，转让11项，开发出5类（项）创新性医药或医疗产品。根据其专利开发的国际首个多肽类抗艾滋病药物（恩夫韦肽）于2003年获美国FDA批准上市，因此而开辟了病毒融合/入侵抑制剂新领域，并在该领域内保持国际领跑地位。近期开发出国际首创的通用冠状病毒融合抑制剂候选药物（EK1多肽），现在Ⅲ期临床试验中。引领开发的HPV入侵抑制剂产品，应用于中国千余家医疗机构，近百万患者受益。在国际上率先证明SARS-CoV S蛋白RBD具有高中和免疫原性，从而开辟了靶向RBD的冠状病毒疫苗和抗体新领域。研发出系列冠状病毒候选疫苗和中和抗体，包括国际首创的基于RBD/新型佐剂的高效和长效泛萨贝冠病毒候选疫苗。