摘 要
为了实现碳中和绿色经济，人们利用生物炼制技术对二氧化碳（CO2）进行转化利用。其中，微生物电合成（MES）是通过电能驱动生物催化剂将CO2转化为化学品的新兴技术。目前MES仍存在微生物固碳效率低、电子传递机制未明确、产品合成速率低、反应器元件适用性差等问题，这成为其规模化应用的限制因素。本文基于阴极微生物获得电子的途径，系统综述了电极、H2、甲酸、CO以及其他电子供体在MES系统内的电子供给机制。通过合成生物学改造电活性微生物的导电纳米线，优化微生物相关氢化酶、甲酸脱氢酶和CO脱氢酶的表达是提高电子传递效率的有效方法。进一步通过阴极修饰，强化微生物-电极间电子传递速率、提高生物相容性，提供更多的还原力有利于高附加值产物的生成。除了增强阴极的电子传递效率，构建具有高效气液固传质和电子传递的反应器、降低阳极电解水电位和调控微生物活性等也被证明是提高MES性能的重要策略。未来需要进一步解析微生物电子传递机制，利用合成生物群落的方式强化MES的性能，并构建更加高效的电极界面，兼顾电子传递速率、底物传质和生物相容性。反应装置放大方面，可通过多种方式的结合来提升电子传递和气体传质，并将产物的分离也融合在一起，推动该技术的进一步发展，为“双碳”目标的实现提供新思路。
全 文
21世纪受人口增长和经济发展的影响，全球能源消耗也呈现指数式增长趋势，多样的环境和能源问题愈演愈烈。温室气体的排放导致全球气温上升、海平面上升和土地荒漠化，这严重破坏了地球生态平衡，危害了人类的生存环境。2020年我国提出“碳达峰、碳中和”的发展目标，开发新能源替代传统化石能源，以此减少二氧化碳（CO2）的排放，同时利用人工固碳技术将来自工厂和大气中的CO2进行富集与封存。然而这并不能从根本上减少CO2，被封存的CO2仍然需要被进一步转化，从而实现碳经济的循环。
利用微生物转化CO2为高附加值增值化学品被认为是实现循环碳经济的有效方法之一，属于第三代生物炼制技术。其不仅能够缓解环境问题，也是对最丰富廉价碳资源的有效利用。而微生物电合成（microbial electrosynthesis，MES）技术，通过外加很小的电势/电压，电自养微生物可利用阴极上传递的电子，经生物固碳途径将CO2还原成多碳精细化学品，在此过程中微生物催化剂可以自我更新。相较于无机电催化还原CO2，MES借助微生物自身灵活多样的代谢途径和代谢工程技术，能够将CO2还原为酸、醇、萜烯、生物聚酯等长碳链化合物。与传统的植物通过光合作用利用太阳能转化CO2相比，MES光电转化效率更高，可直接获得化学品，无需对生物质进一步加工，降低了处理生物质过程中的能耗与环境污染，在环境与能源领域正受到越来越多的关注。此外，MES具有很高的能量转化效率，电能转化为化学能的效率超过80%。因此，MES不仅是一种前沿的负碳技术，也为可再生能源的储存提供了新的思路，有望为“双碳”目标实现提供新的技术方案。
在MES中，CO2的还原主要通过还原乙酰辅酶A途径（Wood-Ljungdahl pathway，WLP）和卡尔文循环（Calvin-Benson-Bassham cycle，CBB cycle）。随着基因技术的进展，研究人员对微生物的电子传递途径以及相关基因片段进行了深入研究，通过合成生物学方法对微生物进行改造使其更适用于MES体系的研究。新的反应器元件被陆续开发出来，这些元件的修饰和改造伴随着MES体系的发展，这为MES体系的大规模应用提供了可能。然而目前MES系统仍存在碳固定效率低、电子传递机制未明等问题。本综述基于电子供体方式的不同，论述了合成生物学方法在MES体系应用的潜力，同时总结了目前MES体系中工程强化的策略进展，并展望了MES技术未来的发展方向。
1 阴极电子供体方式及强化策略
不同的阴极电子供体会影响电子传递速率以及生物催化转化CO2到化学品的种类，因此是限制MES性能的主要因素。目前阴极电子供体方式（图1）主要有基于电极直接电子传递，氢气（H2）介导的间接电子传递，甲酸介导的间接电子传递，一氧化碳（CO）介导的间接电子传递，有机/人工电子供体等。表1总结了5种电子供体的原理、优势和缺点。
图1 微生物电合成的阴极电子传递方式
表1 微生物电合成中的电子供体方式
1.1 电极作为电子供体的直接电子传递
电极作电子供体进行的直接电子传递（DET），指的是微生物通过细胞色素蛋白或者纳米导线和电极物理接触，微生物可从电极上直接获得电子将CO2转化为化学品。细胞色素蛋白是电活性微生物胞外导电的主要元件，它的位置分布特殊且功能明确，在电极的直接电子传递中起着重要的作用。纳米导线最早由Lovely等在Geobacter sulfurreducens的细胞表面发现，纳米导线主要由微生物的导电鞭毛（electrically conductive pili，e-Pili）或相关的色素蛋白组成，e-Pili长达几十微米，可以支持较长距离的直接电子传递。
典型通过细胞色素蛋白进行直接电子传递的微生物是Shewanella oneidensis，通过过表达S. oneidensis MR-1的C型细胞色素蛋白CymA来提高微生物直接传递电子的速率，这一策略将微生物燃料电池的最大功率密度提高至436.5 mW/m2，是未改造菌株的3.6倍。这种提高CymA的方法也可用于增强MES中微生物直接获得电子的传递速率。除了对相关蛋白的表达水平调控外，整体蛋白的结构优化也能提高电活性微生物的直接电子传递。由于细胞色素蛋白复杂多样，许多色素蛋白的表达并不利于电子传递，Gescher等敲除周质色素基因nrfA、ccpA、napB和napA，并在相应敲除位点表达色素蛋白CctA，随着cctA基因的表达电子转移率明显提高，使得生物电化学系统中的铁还原率提高了1.7倍，电流产生提高了23%[图2(a)]。
图2 直接电子传递相关策略
电极可以通过纳米导线为电活性微生物提供电子，但由于菌株本身的差异性以及生长环境不同导致纳米导线的丰度和排列结构差距较大。为了增强微生物的直接电子传递性能，研究者们对微生物的e-pili的形成和构造进行了探究和改造。Liu等在G. sulfurreducens中鉴定出一种菌毛合成的伴侣蛋白（short pilin chaperone，Spc），Spc可以和菌毛单体蛋白（pilA）产生静电作用以此形成稳定的复合体Spc-pilA，Spc特定于组装e-pili相对较短的pilA单体，是形成e-pili的重要组成部分[图2(b)]。Leang等研究了缺失基因对碳和电子流向的影响，结果发现缺失fliA基因导致Clostridium ljungdahlii无鞭毛产生，使C. ljungdahlii失去运动性。这反向性地给出一定的启示，通过过表达fliA基因也可以增强C. ljungdahlii在电极表面的附着，从而促进生物膜的形成，增强C. ljungdahlii的直接电子传递速率。增强单个导电菌毛的导电能力也是提高微生物直接电子传递能力的有效手段，通过将色氨酸掺入菌毛中使得单个菌毛的电导率提高超过80倍，进一步结合金纳米颗粒，形成有序的有机-无机杂化生物材料，使其导电性提高了170倍。这表明通过合成生物学手段能够大幅提高导电菌毛的导电能力，同时也可以根据不同目标电极来构建具备特异性的导电鞭毛结构来增强整体结构的导电性能。Ueki等设计短肽标签与G. sulfurreducens菌毛的羧基端融合，在不影响其导电率的前提下，可产生特异性黏附力的纳米导线结构，这能够增强电活性微生物通过纳米导线从电极获取电子的稳定性。
通过电极修饰来提高直接电子的传递速率，是MES中常见的强化方式。Song等使用电自养微生物将氧化石墨烯还原获得石墨烯-生物膜电极，层层组装的过程使得电极表面形成了微生物-石墨烯网状交错结构，这加速了生物膜的电子传递速率，使得乙酸的产生速率提高了1.54倍[图2(c)]。利用泡沫镍三维网状结构提升微生物的附着面积，并同时修饰石墨烯以提高电子传递速率，最终70%的电子被回收，28天内乙酸浓度达到5.46 g/L，乙酸产率达到了0.195 g/(L·d)。Tahir等构建了具有大孔和高导电率的CNT-二维过渡金属碳化物生物阴极，该方法增强了阴极表面电子的转移，独特三维结构和丰富的活性位点富集了更多的微生物，最终获得了高于其他组1.5倍的丁酸盐产量。Marshall等在MES反应器中添加了30 g石墨颗粒作为阴极，提高阴极的比表面积。实验末期，Acetobacterium、Sulfurospirillum、Rhodobacteraceae成为颗粒电极上主要的微生物，电化学分析表明，直接电子转移有助于乙酸盐的产生，乙酸的产率达到1.04 g/(L·d)。Jourdin等以3D结构的泡沫碳作为基体，电化学沉积CNT来加速电子传递，增强微生物与电极的相互作用和微生物胞外电子转移，最终乙酸的浓度达到了0.685 kg/(m2·d) [图2(d)]。此外，也可通过在电极中引入金属，增强电极的导电性，使得电极带正电荷，有利于微生物的附着进行直接电子的传递。Nie等在石墨上嵌入锚定镍纳米线，从而有利于生物膜的形成，提高电子传递速率。此外，Zhang等利用壳聚糖或三聚氰胺来修饰碳布，使其带正电荷，有利于微生物的附着，提高直接电子传递速率，使得乙酸的产生速率提高了6～7倍。
1.2 H2作为电子供体的间接电子传递
H2作为间接电子供体也被广泛应用在MES中，在MES中通过H2介导的电活性微生物有乙酸菌，如Sporomusa ovate、C. ljungdahlii，其具备WLP途径，可以利用H2来加速乙酸等脂肪酸的生成。
MES中的电活性微生物利用H2作为电子供体主要依靠的是细胞内的氢化酶。以C. ljungdahlii为例，在WLP途径中H2的利用主要依靠氢化酶复合酶，其是由HytA-E、HytA-D和Fdh三个亚基组成，H2在氢化酶复合酶的催化下氧化，同时生成Fd2–和NADH/NADPH。NADH/NADPH作为还原当量参与CO2的固定，而电子分叉酶 Nfn 负责 Fd、NADH 和 NADPH 的相互转化，同时Fd2–也参与Rnf复合物产生质子梯度，产生的质子梯度被用于ATP合酶以产生ATP。氢化酶作为H2氧化产电子的关键酶，对其进行合成生物学相关改造可增强其利用H2作为电子供体的效率。Chao等以大肠杆菌为模板，对大肠杆菌的内源氢酶基因进行了研究，过表达内源氢酶HYD-1和HYD-2分别导致琥珀酸产率增加26.5%和36.7%。为了进一步提高H2的利用率，在菌株中设计了还原性三羧酸循环（rTCA）和CO2补充的途径，该菌株的琥珀酸产率最高，达到了1.50 mol/L。这表明过表达氢酶基因，同时设置相关补充途径能够提高菌株的H2利用率，将H2这一电子供体的作用放大。Li等将Ethanoligenens harbinense的摄取氢化酶（Hyd2293）在Clostridium tyrobutyricum中异源过表达，结果显示突变菌株Ct-Hyde293的丁酸产量降低了34%，电子更多地流向了丁醇，同时乙酸的产量提高了148%[图3(a)]。摄取氢化酶的过表达将电子更多地导向丁醇。上述合成生物学方法为提高H2介导MES的电子传递速率和传递方向提供了思路。
图3 H2介导的间接电子传递相关策略
同样可以利用H2的还有Ralstonia eutropha，其可以通过卡尔文循环实现H2的利用，主要通过CBB循环来固定CO2，氢化酶催化氢气氧化生成电子和质子。R.eutropha含有4种氢化酶：膜结合氢化酶（MBH）、可溶性氢化酶（SH）、调节氢化酶（RH）和NiFe氢化酶（Hyd4）。MBH由HoxK和HoxG结构亚基组成，它们通过HoxZ锚定在膜上。该酶将电子传递给b型细胞色素，并进一步传递给电子传递链，这为R. eutropha提供了能量，而质子则传输至周质中为后续的ATP合成提供质子梯度。SH主要由HoxH、HoxY、HoxF和HoxU亚基组成，其主要负责将质子和电子传递给NAD+以产生NADH，这些NADH被进一步用于固定CO2。R.eutropha的基因优势使其完美契合于有氧参与的MES系统，在单室MES体系中，R. eutropha可以利用H2、O2、CO2合成聚羟基丁酸酯（PHB），PHB是一种可以代替石油基的生物塑料。但单室反应器会造成O2在阴极还原生成活性氧（ROS），ROS会影响微生物的生长代谢。研究人员为了克服这一阻碍，对R. eutropha进行了分子改造，使其生产具有还原性的番茄红素，其可以和ROS反应，以减小ROS对微生物生长的影响，从而提高MES的反应效率[图3(b)]。有研究人员将高效的外源RuBisCO（核酮糖-1,5-二磷酸羧化加氧酶）引入到R. eutropha中，并结合内源GroES/EL伴侣蛋白进行过表达，同时，通过调节MBH和SH的表达来优化氢化酶的表达，可以提高R. eutropha的自养生长效率。在使用H2、CO2和O2时，PHB产量显著增加了99.7%。除此之外，乙酸菌的WLP途径也是MES中还原CO2的重要途径，以C. ljungdahlii为例，其通过细胞内部的氢化酶氧化H2以获得还原力并与WLP途径耦合还原CO2。C. ljungdahlii的H2氧化主要贡献于铁氧还原蛋白的还原，随后通过Rnf复合物铁氧还原蛋白被氧化产生了NADH以还原CO2，同时形成了H+梯度以促进ATP的合成。C. ljungdahlii的H2利用途径表明，提高H2的电子传递效率要着重于氢化酶和Rnf复合物的改造，氢化酶是提供还原力的源头，而Rnf复合物是重要的中心代谢阻碍，它直接影响着微生物的生长和代谢。
利用析氢催化剂修饰阴极，可降低氢气的析出电位，使得更多的电子供体H2生成，提供更多的还原力给微生物还原CO2。Fontmorin等利用导电聚合物聚苯胺来修饰阴极，加速阴极析氢反应（HER），促进了微生物产丁酸盐的速率。此外，钴、铁、镍、钼等过渡金属是良好的析氢材料，可用于MES体系提高HER性能。Tian等将Mo2C析氢催化剂引入反应器的阴极，结果表明负载了Mo2C催化剂的阴极析氢速率（2.29×104 mol/d）提高了12.7倍，并获得了0.19 g/(L·d)的乙酸盐产率，是对照组的2.1倍。利用水热还原法制备了高HER活性的MoS2析氢催化剂，获得的MoS2催化剂呈现多孔纳米花结构，有利于更多的析氢位点暴露，并且其纳米花结构也有利于电子传递速率的增强，最终析氢速率提高4.3倍，乙酸盐产量达到了0.20 g/(L·d)[图3(c)]。Tian等设计了一种多功能钙钛矿基阴极材料Pr0.5BSCF-CF，该材料同时增加了CO2吸收和H2产量。结果表明，Pr0.5BSCF-CF实验组的乙酸产量为13.74 g/L，在70天内乙酸盐产率为0.24 g/(L·d)。但是过渡金属系列的析氢催化剂，金属容易在溶液中泄漏，从而影响到微生物的活性。Liu等使用CoPi阳极和CoP合金阴极构建的MES系统，在实现利用析氢催化剂提升H2介导电子传递的同时，抑制ROS的生成。进一步阳极CoPi能够氧化来自阴极泄漏的Co3+到Co2+，并重新沉积在电极表面，从而降低溶液中钴离子对微生物的毒害，最终获得了0.14 g/(L·d)的PHB产率[图3(d)]。此外，Luo等利用S.oneidensis MR-1可接收阴极电子来产氢的特性，使其与氧化石墨烯自组装构建非金属型的析氢催化剂，促进了H2的生成，是未修饰的3.1倍，C. ljungdahlii转化CO2产乙酸盐和丁酸盐的产率分别为0.18 g/(L·d)和0.07 g/(L·d)。
此外，也可在阴极中引入光催化剂，通过光生电子作用来提升HER性能。石墨氮化碳（g-C3N4）是一种低成本的可见光响应的半导体材料，Cai等以Serratia marcescens Q1作为生物催化剂，构建了具备Z型异质结的WO3/MoO3/g-C3N4，光生电子有利于氢气的析出，空穴作为额外的驱动力诱导更多的阳极电子传递过来，最终获得了0.19 g/(L·d)的乙酸盐产率。进一步Kong等构建了Ag3PO4/g-C3N4光催化剂，通过在Ag3PO4价带上形成的光生空穴驱动水氧化产生H2O2，抑制了Ag3PO4的光腐蚀，最终在–1.1 V（vs SHE）获得0.32 g/(L·d)的乙酸盐产率。此外，还可通过构建具有更负导带的MnFe2O4/g-C3N4和具有掺铝ZnO（AZO）薄膜层组成的光管理系统，来提升光催化产氢的能力，以增强基于S. marcescens Q1的MES性能。
利用光催化剂来强化氢介导的电子传递作用，也可用于基于混菌体系的MES系统。Song等通过水热还原合成了CuO/g-C3N4光催化剂。CuO/g-C3N4光激发产生的电子，可通过直接和间接经氢气的方式，传递给微生物，并使得Acetobacterium和Arcobacter的丰度显著富集，乙酸盐产率达到了0.16 g/(L·d) (–1.05 V vs Ag/AgCl)。在CuO/g-C3N4中掺入rGO，以提高光生电子空穴分离能力、光的吸收强度以及电子传递能力，从而使得其乙酸盐产率达到了0.27 g/(L·d)。进一步构建α-Fe2O3/g-C3N4 Z型异质结光催化剂，加速了光生电子空穴的分离速率，提升了H2的产生，同时研究发现α-Fe2O3可以与细胞色素C相互作用，也促进了电极与细菌之间的直接电子转移，使得其乙酸盐产率达到了0.33 g/(L·d) (–0.9 V vs Ag/AgCl)。
1.3 甲酸作为电子供体的间接电子传递
甲酸是一种良好的电子供体，相比较H2在溶液中低的溶解度，甲酸盐在溶液中是高度可溶的，并且甲酸盐对微生物表现出低毒性，更容易被微生物利用，通过生物合成形成有价值的化学品。
合成生物学方法可针对甲酸同化路径以及甲酸代谢途径中的反应关键酶的改造，以提高甲酸的代谢速率。在E. coli为代表的微生物中，rTHF-rgcv途径的关键酶GCS更倾向于甲酸的裂解而非合成。为了促进GCS合成甘氨酸，通过过表达E. coli中的内源GCS，同时敲除抑制甘氨酸合成的gcvR基因，得到的工程菌株E. coli RG1能够更好地转化甲酸与CO2生成甘氨酸。进一步，在E. coli中构建敲除serA基因的rTHF-rgcv途径，以促进5,10-亚甲基四氢叶酸的合成，使得rTHF-rgcv途径的丙酮酸合成通量达到了总通量的12.9%，与未改造菌株相比提高了7.3%。除了针对E. coli进行的合成生物学改造，近年来针对C. ljungdahlii和R. eutropha甲酸代谢途径的研究逐渐涌现，这两种微生物都是MES中的典型电活性微生物。
R. eutropha能够以甲酸盐为唯一的碳源和能量来进行生长，R. eutropha以Mo为活性中心，依赖NAD+的甲酸脱氢酶，其可以催化甲酸氧化为CO2，将NAD+还原为NADH。R. eutropha甲酸脱氢酶主要由fdsGBACD操作子编码，其由七个铁/S簇、FMN和一个钼中心组成。为了提高R. eutropha在甲酸盐上生长的适应性，Calvey等删除存在于染色体外巨质粒pHG1上的大基因组区域，构造了一个合理的工程ΔphcA和巨质粒缺陷菌株，其在甲酸上的最大生长速度提高了24%，甲酸盐的消耗速率为5.11 g/h±0.37 g/h，相比于野生型增加了32%。也有研究者通过异源表达以扩大R. eutropha利用甲酸盐生产的产物谱。Collas等将异源巴豆酸盐途径导入R. eutropha中，使甲酸转化为巴豆酸，巴豆酸的产量达到了148.0 mg/L，是对照的2倍。Li等利用电化学催化将CO2和水转化为甲酸，工程化的R. eutropha H16 可以很好地利用甲酸，来产生生物燃料（0.846 g/L异丁醇和0.57 g/L 3-甲基-1-丁醇）[图4(a)]。有研究者从辅酶A的途径出发对R. eutropha进行改造，Black等在含有四个异源基因phaJ、ter、bldh和yqhD的多拷贝质粒上构建了一个合成操纵子，重组了R. eutropha中的新型辅酶A依赖性途径，使得R. eutropha利用甲酸可生产30 mg/L正丁醇。
图4 甲酸和CO介导的间接电子传递
以C. ljungdahlii为代表的乙酸菌可以通过WLP途径利用甲酸，在WLP途径中，甲酸脱氢酶可将CO2还原成甲酸，随后通过合成酶合成四氢叶酸（THF），生成甲酰THF以进入WLP途径的甲基分支，在多酶的作用下合成乙酰辅酶A。针对乙酸菌利用甲酸的合成生物学改造主要集中在WLP途径的甲基分支中，Straub等从C. ljungdahlii中提取处理甲酸的4种依赖四氢呋喃的酶以及磷酸反式乙酰化酶和乙酸激酶的基因片段，并异源过表达在Acetobacterium woodii中，结果显示转基因菌株的乙酸盐产量得到了提高，在H2和CO2的气氛下进行微生物发酵，得到了9.61 g/L的乙酸盐产率，这要高于对照组的8.16 g/L。
利用甲酸催化剂通过电催化将CO2转化为甲酸，生成的甲酸作为电子供体来促进微生物产生更多的还原性物质，在MES中也有相关报道。Qiu等采用Sn作为甲酸催化剂，通过电沉积制备Sn改性阴极，结果表明Sn修饰后的电极，其甲酸选择性可以达到20%，要高于未修饰组的。Lim等在气体扩散电极上沉积了Sn催化剂，然后通过电化学将CO2转化为甲酸盐，并利用循环泵将甲酸盐传递给R. eutropha，使其发酵来产PHB。当气体扩散电极的电极面积为4 cm2时，120 h可生产1.38 g PHB，生产率达到了0.28 g/(L·d)。Liu等通过水热合成制备了具有大比表面积、高分散度、良好界面结合性能的Bi2O3葫芦状电极，该电极具有高的甲酸选择性（92.4%）以及良好的生物相容性，最终使得MES中乙酸盐产量达到0.27 g/(L·d)[图4(c)]。
1.4 CO作为电子供体的间接电子传递
CO在WLP途径中既可以充当电子供体又可以作为碳源被利用，以C. ljungdahlii为代表的乙酸菌可以通过CO脱氢酶（CODH）将CO转变为CO2提供额外的还原当量，这些还原当量被用来合成更多的还原产物，例如乙醇、2,3-丁二醇等。
WLP途径由两个线性分支组成，将CO和CO2结合到生物分子中，通过双功能酶CODH/乙酰辅酶A合酶（ACS）产生乙酰辅酶A。当仅有CO2作为碳源时，WLP途径通过CODH与ACS组成的复合酶将CO2还原为CO并与甲基缩合形成乙酰-CoA。当存在CO时，CODH可以将CO氧化为CO2以提供额外的还原当量，同时CO也可以直接被利用与甲基缩合为乙酰-CoA间接提供还原当量。这一过程中NAD+/NADH的循环再生依托于Nfn和Rnf两种复合物的配合。所以对于利用WLP途径固定CO2的乙酸菌，CO是良好的电子供体。为了探究WLP途径中CO作为电子供体时相关的关键基因，Fast等将C. ljungdahlii中WLP途径的11个核心基因异源表达于Clostridium acetobutylicum，通过13C标记跟踪甲酸生成5，10-亚甲基四氢叶酸以及CO2生成CO的情况，结果表明与CODH组合的ACS呈现低水平表达，从而影响了乙酰-CoA的生成。这表明CO作为电子供体时，ACS也是限制其电子传递的关键酶之一。此外Zhu等也对H2/CO2和CO下培养的C. ljungdahlii进行关键酶活性测定、代谢通量分析和转录组学分析，结果表明在CO发酵中乙醛：铁氧还蛋白氧化还原酶主要促进了乙酸酯到乙醛的反应。
CO作为电子供体的利用也受到CODH表达水平的影响，在合成生物学改造中，对CODH进行过表达可以增强CO利用。有研究表明共过表达CODH、辅酶CooC2和ACS的突变菌株（ELM031）显示出3.1倍的特定CO氧化速率以及1.4倍的特定乙酸生成速率。ELM031通过上调铁氧还蛋白和与能量转化直接相关的代谢而增强了还原潜力。CODH在MES中也被证明可以提高CO的利用率，Song等将酵母提取物加入MES体系的阴极，以考察CO作为MES底物的性能，结果显示酵母提取物可提高CODH活性，CODH活性较高时，乙酸酯和挥发性脂肪酸（VFA）的含量分别达到0.173 g/(L·d)和0.39 g/(L·d)。CODH活性较高时，使用CO进行电合成的最大库仑效率是使用CO2电合成的2倍，进一步表明CODH的活性能够影响MES转化CO的性能。
目前MES中关于CO的相关研究较少，将CO引入MES体系仍需攻克一些问题，比如CO对电极的毒化作用会导致反应器启动周期较长。Chu等评估了不同比例的CO/CO2混合气对MES性能的影响，结果表明在CO/CO2的浓度比为50%∶50%时，C4和C6羧酸盐的生产性能最佳，其中乙酸盐的电子回收率为43.11%±1.31%、丁酸盐为34.11%±0.11%、己酸盐为15.41%±1.48%，这说明CO的加入有利于碳链延伸。此外，有研究人员将CO催化剂引入MES体系中，通过将CO2转化为CO，然后再被微生物利用。这样使得反应过程具有较高的CO法拉第效率（92%），并可调节CO/H2比例来促进MES反应。更进一步，Zhu等在多孔3D阴极中引入了高选择性的钴酞菁催化剂，将CO2转化为合成气（H2、CO、CO2），实验结果表明3D多孔电极允许更稳定的CO和H2的产生，配合阴极液的循环，最终乙酸盐的产率为1.4 g/(L·d)，乙醇的产率为0.87 g/(L·d)[图4(d)]。
1.5 有机/人工电子供体介导的电子传递
在MES中，除了H2、甲酸和CO介导的间接电子传递，还有一些其他的电子供体介导的电子传递方式。MES中目前的产物，多以短链的乙酸为主，生成高附加值的长链羧酸盐仍然是一个巨大的挑战，而外加有机电子供体的方式会有利于碳链的延伸。Jiang等通过外加乙醇作为有机电子供体，来促进微生物转化底物向己酸盐的生产，在7天的反应中，获得了2.41 g/(L·d)的己酸盐产率，己酸的选择率达到了91.47%。Zhang等使用乙醇和乳酸作为杂交电子供体为MES提供额外的还原当量，杂交电子不仅提供了足够的还原力，而且通过乳酸原位释放的CO2提高了气体传质速率，最终在7天分别获得了0.90 g/(L·d)的丁酸产率以及0.23 g/(L·d)的己酸产率，电子回收率达到了94.51%。通过宏基因组发现反β氧化途径和脂肪酸生物合成途径是MES产生中长链脂肪酸的主要途径。同时也证明了不同的接种源会影响产物谱的种类，从沉积物中而来的Caproiciproducens、Clostridium和Rummeliibacillus是生产丁酸和己酸的关键微生物。Wang等提出了有机/无机共培养的策略，即在反应过程中加入少量葡萄糖作为电子供体，来刺激微生物对CO2的利用，并获得碳链的延伸。通过宏基因组学分析发现，混合培养降低了WLP途径和反β氧化途径，脂肪酸生物合成途径的丰度逐渐提高，证明了链延伸主要通过反β氧化途径进行。同时证明了H2驯化的微生物菌群更有利于C4~C6产物的生产，最终获得了0.036 g/(L·d)的丁酸盐产率[图5(a)]。Izadi等在以CO2为原料的反应器中分别提供甲酸盐和乙醇反应45天，在添加甲酸后，丁酸和丁醇的产量显著提高，而乙醇的添加则增加了产物的多样性，丁酸盐的最终浓度达到了0.06 g/(L·d)。Li等研究了在MES反应器中不同的碳链延伸方法。通过在三室反应器中进行原位碳链延伸，最终获得了0.33 g/(L·d)的己酸盐。由于原位反应器中部分乙醇被用于生产丁酸等其他产物，因此非原位（78.7%± 1.5%）表现出高于原位（56.4%±0.5%）的己酸产率。同时，通过同位素示踪技术证实了CO2和乙醇同时被微生物利用，并参与碳链延伸。
图5 有机电子供体和人工电子介体介导的间接电子传递
表2总结了微生物电合成的阴极强化情况。
表2 微生物电合成的阴极强化
Song等添加不同的人工电子介体以考察其对MES体系的影响。结果发现，中性红（NR）和2-羟基-1,4-萘醌（HNQ）的加入显著提高了乙酸合成效率，表明这些介质提高了悬浮细胞与电极之间的电子传递能力，添加NR或HNQ的MES乙酸产量更高。此外，Im等还针对MES转化CO进行相关人工电子介体的探究，结果显示HNQ介导的MES体系可以将CO转化为更多的乙酸盐，乙酸盐的产率达到了0.10 g/(L·d)。除了在电解液中添加人工电子介体，在电极上负载人工电子媒介体也可以促进电子传递效率。Tian等利用人工电子介体普鲁士蓝来修饰阴极，利用二价铁和三价铁在细胞的电子传递，以显著提高阴极的电化学性能，这种修饰方式也增强了生物催化的活性，并且修饰后的电极兼有亲水性和正电荷，提高阴极的生物相容性，加快了微生物电合成产乙酸盐的速率[图5(b)]。
2 其他强化MES转化CO2到化学品的策略
典型的MES结构，是质子交换膜将反应器分隔成阳极室和阴极室，CO2在阴极被微生物还原成化学品。现行的研究，多是通过强化阴极的电子传递速率来达到增强MES效率的目的。但是在MES反应的过程中，其他因素也会影响生物催化CO2转化成化学品的速率。如反应器结构会影响到气体的传质和产物的生成分离等，阳极催化的半反应速率会影响到施加的电位和电子传递速率，微生物尤其是混菌的驯化或调控也会影响到微生物转化CO2到化学品的种类和速率（图6）。因此，以下对反应器结构、阳极修饰和微生物活性调控方面的强化策略进行展开综述。
图6 MES转化CO2到化学品的其他强化策略
2.1 反应器优化增强MES性能
从微生物电子传递速率及微生物生长代谢角度出发，MES反应器要具备良好的气液传质性能，要为微生物提供优良的附着条件，要确保有足够大的电极表面积为微生物与电极的物理接触提供条件。但对这些条件优化的同时，也要考虑到其对电化学性能的影响。为了获取优良的电化学性能，MES反应器还要确保低的电阻，并需要考虑浓差极化以及电极过电位等因素。而传统的H型反应器由于结构问题，其内阻较大，且气液传质能力较差，并不利于MES体系的放大，为此研究人员基于MES体系的特点开发了不同类型的反应器。
为了减小反应器内阻同时增大电极面积，研究人员设计出了一种板框堆叠式反应器，这大幅缩短了阴极和阳极之间的距离，减小了内阻。与H型反应器相比，板框堆叠式反应器具有更加灵活的可扩展性，可以实现多个腔室的组合，有利于MES体系的进一步放大。Gildemyn等设计了一种三室板框式反应器，通过阳离子和阴离子交换膜，使得阳极室和阴极室之间形成萃取室，最终获得了13.5 g/L的乙酸产量，这一设计不仅提高了乙酸盐的产率，同时可将产物直接分离到中间萃取室中，减小产物对阴极微生物的毒害作用[图7(a)]。同样板框式堆叠反应器也可利用三个模块在一起，让阴极液循环穿过阴极，通过外部循环，在大面积的电极上形成了厚实又坚固的生物膜，并通过提高传质来促进MES的性能。
图7 反应器元件改造
此外，将MES反应器和传统生物发酵反应器相结合也是一种优化思路。气液传质效率低是影响MES性能的重要因素，而传统的生物气体发酵反应器可通过高压、搅拌和填料等提高气液传质效率，可将其借鉴用于MES的反应器的优化。Hintermayer等将1.8 L高压灭菌搅拌罐生物反应器进行了改装，使反应器作为MES运行，这样将原有的双室变成了更利于发酵的单室反应器，并将生物反应器与电化学技术良好地结合在一起。研究人员还根据搅拌釜提高传质，建立了连续搅拌釜式MES反应器，装置不仅极大地缩小了阴极与阳极之间的距离，并有效提高了传质速率，最终得到了2.14 g/(L·d)的乙酸盐产率[图7(b)]。除了通过搅拌改变传质效率，通过外部压力改变气液传质效率也是有效的方法。Giddings等使用具有垂直分离的阳极和阴极的单室设计，构建了鼓泡塔式MES反应器，可以利用介质压力提高气体底物以及间接电子供体H2的气液传质效率。基于这一研究，Enzmann等设计了一种双室鼓泡塔反应器，将其运用于MES转化CO2产甲烷研究中，48 h后甲烷产率为0.59 g/d，并减小了阴极与阳极之间的距离，有效提高了传质速率。
此外，还可在反应器加入填料，催化颗粒等提高反应器中的传质效率。Dong等在MES中加入活性炭颗粒，作为流动电极，提高了微生物和气体的传质速率，实现了乙酸盐产率的2.8倍增长。Zhou等通过将聚乙烯填料引入到MES反应器中，通过填料的阻隔和剪切作用延长气体的停留时间，最终得到了0.18 g/(L·d)的乙酸盐产率，是对照组的1.6倍。Cai等将流化床引入到鼓泡塔反应器中，改进出了一款电解H2移动床生物膜反应器，获得了1.42 g/(L·d)的甲烷生产速率[图7(c)]。Pan等向反应器中添加二氧化硅纳米颗粒来增强氢的传质。投加量为0.3%的时候，使反应器内H2的体积传质系数提高了32.4%，使乙酸产率和库仑效率分别提高了69.8%和69.2%。
此外，还可通过优化反应器中的电极结构来提升反应过程中的气体传质速率。Fu等开发了一种多孔中空不锈钢/石墨烯泡沫（GF）电极，该电极具有大的比表面积和较高的气体传质性能，提高了电极的生物负载量，甲烷的产量可达到13.57 g/(m2·d)，是对照的3.6倍，甲烷的法拉第效率高达84.2%。Alqahtani等制备了中空纤维电极，这种新型电极由多孔镍中空纤维组成，它既可作为析氢催化剂，又可作为气体转移膜，通过中空纤维的孔将CO2直接传递到阴极附着的生物催化剂，其甲烷的法拉第效率高达77%[图7(d)]。Rodrigues等制备了全氟碳纳米乳剂，加入溶液中，解决了H2在溶液中溶解度低的问题。最终获得了1.6 g/(L·d)的乙酸，法拉第效率接近100%。
2.2 阳极优化提高MES性能
一直以来MES的研究侧重点都集中在阴极修饰，但是阳极发生电解产氧（OER）的反应，也会影响到MES的性能，其可通过光催化的方式来增强OER的反应。最早报道的光阳极协助MES，是在FTO上负载TiO2，通过光催化剂反应来降低OER的过电位，从而提高MES反应的速率。可是TiO2只响应紫外线，其只占太阳光中的5%，限制了光阳极的使用范围。BiVO4作为一种在可见光激发下的光催化剂，其具有相对较窄的带隙，并且其VB边缘位置比析氧电势（1.23 V vs. RHE）更正，因此BiVO4作为光阳极进一步被研究。Bian等在FTO上负载了BiVO4/Mo作为光阳极，其导致了25%的电流密度增加和46倍的乙酸产率提高，太阳能转化乙酸效率达到0.97%±0.19%。Li等将BiVO4负载到MES中常用RuO2-IrO2/Ti电极上，以提高光阳极的抗腐蚀性和电子传导性。BiVO4与RuO2-IrO2/Ti的耦合提高了光生电子和空穴分离速率，提高OER反应速率，并进一步在ZIF-67/g-C3N4光阴极的协同作用下，在–0.9 V（vs Ag/AgCl）下，乙酸盐产率达到了0.46 g/(L·d)，太阳能的转化乙酸效率达到1.52%。并且在–0.6 V（vs Ag/AgCl）下，依然能获得0.09 g/(L·d)的乙酸产率[图8(a)]。此外，Gupta等在活性炭纤维毡上负载g-C3N4-NiCoWO4，通过Z型异质结来抑制光生电子空穴的复合，改进OER的反应速率，得到了0.58 g/((L·d)的甲酸产率，太阳能到甲酸的效率达到1.48%。
图8 阳极改造和菌群活性调控
除了利用光阳极强化OER反应之外，也可通过其他阳极半反应来降低过电位，提高MES的反应速率。Gong等评估了硫化物作为阳极半反应的作用，并且在阳极引入Desulfobulbus propionicus菌株以增强阳极氧化底物的速率。首先硫化物在阳极电催化的作用下氧化生成两个电子，随后硫被D. propionicus进一步氧化成硫酸盐再次生成6个电子，这样阳极反应可以产生8个电子。结合阴极的S.ovata进行CO2还原反应，得到了2.99 g/(m2·d)的乙酸盐产率[图8(b)]。Kambara等利用阳极将HS–氧化到SO4–，来代替电势高的OER反应，用于MES阴极微生物将CO2转化到甲烷，并且整个外电路只需要施加0.2 V的电压，即可启动反应。因此，MES阴极在利用CO2转化甲烷的同时，阳极也可用于H2S臭味气体的去除。Xiang等利用产电微生物在阳极氧化水中的有机物产生电子，来增强MES转化CO2到乙酸的效率，最终发现利用双极膜，在外加1.4 V的电压下，相对于对照组，MES中乙酸的产率提升了238%，阳极底物的去除提升了45%。
2.3 调控微生物活性增强MES性能
电活性微生物作为MES中CO2还原的催化剂，其活性将直接影响MES的效能。近年来通过调控微生物的活性来增强MES的性能也逐渐增多。Modestra等将接种物热处理，随后在H2和CO2的条件下不断富集。结果显示热处理后富集的菌群更有利于CO2的还原，且主要产物为乙酸盐，而未处理的菌群主要产物为甲烷。对两种样本进行系统发育分析，结果表明热处理菌群中以梭菌为主，而未经处理菌群中则出现产甲烷菌。Mohanakrishna等开发了一种高盐浓度菌群富集方法，该菌群能够在高浓度碳酸氢盐条件下发挥作用，通过在血清瓶中添加高浓度碳酸氢盐（15 g/L）来进行初步的富集，在MES系统中驯化4个周期后，得到了耐高盐浓度的适用于MES系统的菌群，在–0.8 V（vs Ag/AgCl）的电位下，获得了24.53 mg/(L·d)的乙酸盐产率，库仑效率达到6.82%。Patil等在H2∶CO2条件下，通过多次培养转移富集，得到了可以高效利用H2这一电子供体转化CO2的混合物。这种混合物作为接种，可在MES中产生浓度为0.05 g/(L·d)的乙酸盐。此外，参与MES反应的电活性菌株一般对氧分子都很敏感，这意味着反应器必须严格保持在厌氧条件下，这对MES的放大提出了挑战，而通过菌群活性调控使这些微生物能够适应氧气是可行的手段。Shi等采用逐步适应性实验室进化策略（ALE）来开发S. ovata对氧气的耐受性。获得了两株严重突变的S. ovata菌株，它们在0.5%~5%的氧气条件下自养生长良好。与野生型相比，适应型菌株在MES系统中将电能CO2转化为醋酸的速度快1.5倍，并且可以抵御阳极电解水产氧对微生物的影响。
除了适应性的调控外，通过外部条件的干预以及创造特异性的生长环境也能增强微生物菌群的活性。Luo等利用非离子表面活性剂吐温80作用于阴极生物膜，这使得阴极生物膜分泌更多的胞外聚合物（EPS），有利于阴极的电子传递速率提高。最终添加80 mg/L的吐温80后，乙酸产率是对照的1.42倍，库仑效率达到了76.33%。溶菌酶也可作用于阴极生物膜，降低阴极膜上不导电肽聚糖的含量，提高生物膜的通透性。溶菌酶处理还刺激阴极生物膜释放EPS，以提高电子传递速率。溶菌酶用量为2 g/L时，胞外多糖中相应的外源蛋白含量最高，并产生了最高的乙酸产量，是对照的2倍[图8(c)]。
近年来研究人员发现，通过群感效应使微生物向目标方向转化也是菌群活性调控的有效手段。Li等将酰基高丝氨酸内酯（AHL）群体感应信号加入混菌中。转录组学分析显示，C8-HSL显著提高了CoA-转移酶活性，加速了生物膜的形成。此外，C8-HSL增强了脂肪酸生物合成途径（FAB），这有利于碳链的延伸[图8(d)]。进一步研究不同浓度的自诱导剂在MES中链延伸的作用，发现添加10 μmol/L的4,5-二羟基-2,3-戊二酮会增强阴极电活性生物膜的氧化还原活性，同时有利于反β氧化途径和脂肪酸生物合成途径，最终己酸盐浓度提高了66.88%。
MES的应用展望
本文综述了MES转化CO2的研究进展，主要涉及阴极电子供体方式，包含电极直接作为电子供体，H2、甲酸、CO介导的间接电子传递，以及其有机/人工电子供体方式。为提高MES转化CO2产化学品的效率，采取的多种策略，包括电自养微生物改造、电极修饰、阳极反应增强、反应器结构优化、改进气体传质、提高产物分离、微生物活性定向驯化调控等。在未来研究中，这些策略的进一步组合集成，会开发出性能更优的MES系统。
目前MES转化CO2的核心是生物催化剂，深入理解纯菌转化CO2的电子传递机制，对于通过合成生物学来改造电自养微生物，提高CO2转化效率具有重要意义。一方面，针对已知的电子传递途径，合成生物学方法的改造能够改善既有的电子传递途径。纳米导线和细胞色素蛋白的针对性改造可以增强电活性微生物直接从电极获取电子的能力。而针对可以作为电子穿梭体的H2、甲酸和CO，未来可通过增强相关酶活、构建异源代谢途径和拓宽产物谱等方法，在强化电子穿梭体传递效率的同时，也将电子流路导向了高附加值产物。另一方面，对于MES中混菌转化CO2机制仍需进一步的研究，通过借助宏基因组、宏转录组、代谢组学对混合菌群中各功能微生物的协同作用机制分析，以探明MES中混合菌群的电子传递机制，从而通过合成生物群落的方式强化MES的性能。
从电极修饰角度，构建更高效的生物-非生物界面、提高电子传递效率、兼顾底物的传质性能、良好的生物相容性是主要的研究方向。开发针对不同电子传递的阴极强化方式，如通过3D打印等技术将微生物和电极组装到一起，在提高微生物负载量的同时，可以提高微生物和电极的电子传递，并且3D的电极结构也有利于底物的传质。利用光催化剂进一步提升光生电子空穴，提高光的吸收强度，增强微生物获得光生电子的能力。针对阳极修饰，未来可进一步开发高性能的OER催化剂，并进一步将OER产生的氧气利用起来，用于废弃物的氧化，或者寻找可替代的半反应降低阳极反应的过电位反应。
从反应装置角度，将反应器放大以进一步评估MES的应用是关键。而在反应器放大的过程中，以H2为代表的电子供体受溶解度的限制，会影响到微生物得到电子的传递效率，从而导致低的CO2转化效率。因此，在大反应器中，会施加大的电流，以获得高的CO2转化效率。但过程中，大量的氢气会析出，造成低的库仑效率和能量的浪费。因此，未来反应器的放大中可参考传统生物反应器对气体发酵的改善方法，如加入搅拌和添加填料的方式，提高气体的停留时间。此外，微生物电合成作为气体电发酵的一种形式，可采用中空纤维膜电极的结构来适配反应装置的放大，利用中空纤维膜优良的气液固反应界面，在提高底物传质的同时，提升直接电子传递的效率。未来的反应器放大，可通过多种方式的结合来提升电子传递和气体传质，并将产物的分离也融合在一起。
MES技术在环境治理、可再生能源生产、绿色生物制造等领域具有巨大的应用前景，未来有望应用于人工光合作用用于太空制备食品等。因此还需进一步加强MES体系的研究，加大高附加值产物的生成，提高CO2的转化效率，推动该技术的进一步发展，为“双碳”目标的实现提供新思路。
通讯作者及团队介绍
谢婧婧，南京工业大学 材料化学工程国家重点实验室、生物与制药工程学院教授，博士生导师。2003年获南京大学化学系学士学位，2008年获美国纽约州立大学（State University of New York at Albany）化学系博士学位，2008—2010年先后在纽约州立大学与康奈尔大学担任博士后。2006年获美国科学促进会（AAAS）杰出科学计划；2012年入选教育部新世纪优秀人才；2015年获江苏省“六大人才高峰”；2016年获得中国产学研合作促进会“中国产学研合作创新奖”；2018年获江苏省“333”人才三层次；2022年获江苏省教学成果奖二等奖；2023年指导学生获中国国际大学生创新大赛国家级铜奖。担任2019、2020年度国家重点研发计划“场地土壤污染成因与治理技术”重点专项指南编写专家。目前担任国家重点研发计划子课题，国家自然科学基金，江苏省高校自然科学基金重点项目等在内的20 余项国家与省部级科研课题的项目负责人。主要从事绿色生物制造技术即CO2高效转化、生物电化学技术、重金属污染土壤治理及固废资源化研究，发表 SCI 论文 100 多篇，授权专利20 余项。担任中国中药协会中药新技术委员会常务理事，江苏省生化与分子生物学学会理事。
宋天顺，博士，南京工业大学生物与制药工程 学科教授、硕士生导师。主要从事微生物技术在废弃物资源化方面的研究，内容涉及到微生物电合成转化二氧化碳、固体废弃物生物转化、构建高效生物催化体系等相关研究。江苏省“六大人才高峰”高层次人才资助对象，江苏333工程第三层次培养对象。中国教育部专家咨询库专家，江苏省教育厅及科技厅咨询库专家，南京市江北新区科技咨询专家。已在Applied energy、Bioresource Technology、Science of the Total Environment、Journal of Hazardous Materials、ACS Sustainable Chem. Eng等国内外期刊上发表SCI论文50余篇，已授权发明专利10项。主持了国家自然科学基金，国家重点研发计划子课题，江苏省重点研发计划，江苏省自然科学基金项目（重点）子课题等多项纵向课题。
