初步评估融合T5E的效果
在哺乳动物HEK293T细胞中测试编辑效率，目标基因为小麦的三个内源性位点（TaARE1-D、TaHRC-D和TaSBEIIa）。对比测试了Cas12i3、Cas12i3-5M、ExoI-Cas12i3-5M、T5E-Cas12i3-5M，外加一个LbCas12a。
结果显示，Cas12i3-5M 的编辑效率显著高于 Cas12i3，但融合 ExoI 导致效率下降，而融合 T5E 的 Cas12i3-5M 在所有靶点的效率显著提升（提高 1.26~3.87 倍），且优于 LbCas12a。（图1）
T5E 可能通过降解 5' 突出端，抑制精准修复路径，增强错误修复（NHEJ），从而提高 indel 频率。
实验验证了 T5E-Cas12i3-5M 的高效性，为其在植物基因编辑中的进一步应用奠定了基础。
图1
终极优化版本：Opt-T5E-Cas12i3-5M
该版本采用35S-CmYLCV-U6复合启动子驱动tRNA-crRNA-HDV结构的表达，使用bar作为选择标记基因，在Cas12i3-5M的N端融合T5外切酶(T5E)。
Opt-T5E-Cas12i3-5M相比Opt-Cas12i3提高了高达7.95倍，相比Opt-Cas12i3-5M提高了1.33倍，在4个内源基因位点的平均编辑效率达到63.25%-88.99%。
在TaARE1-D位点，获得77个独立突变体，其中41.56%(32/77)为双等位或纯合突变；在TaHRC-D位点，获得49个独立突变体，67.35%(33/49)为D亚基因组的纯合或双等位突变；在TaSBEIIa位点，获得不同组合的A、B、D三个亚基因组的突变体，包括单基因组、双基因组和三基因组同时突变的类型。
能够产生较大片段的缺失，突变类型多样，包括缺失、插入和碱基替换，缺失大小从几个碱基到100多个碱基不等。（图2）
图2
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