PBJ | 中国农科院万建民院士团队揭示水稻OsNL1-OsTOPLESS2-OsMOC1/3通路调控高位分蘖伸长机制

学术   2024-12-22 07:26   湖北  

分蘖是决定水稻产量的重要性状。到目前为止,大多数研究聚焦于低位分蘖,而与再生稻再生能力有关的高位分蘖伸长的调控机制则仍待揭示。该研究从一个分蘖数增加的突变体nl1中克隆出了与高位分蘖相关的基因OsNL1。其编码蛋白OsNL1与一个转录抑制辅助因子OsTOPLESS2互作,通过OsTOPLESS2招募去乙酰基酶,共同抑制下游基因OsMOC1和OsMOC3的表达,从而调控高位分蘖的伸长。该研究揭示了一条调控水稻高位分蘖伸长的遗传通路,为再生稻分子设计育种提供了理论支持。论文“The OsNL1-OsTOPLESS2-OsMOC1/3 pathway regulates high-order tiller outgrowth in rice” 在线发表于植物学杂志Plant Biotechnology journal 上。
水稻分蘖由腋分生组织(AM)发育而来。它是构成植物结构和影响作物产量的关键因素(Janssen et al,2014)。水稻茎上每个节都有一个分蘖芽,根据其位置水稻分蘖又可分为低位分蘖(LOT)和高位分蘖(HOT)(图S1)。水稻OsMOC1是第一个被鉴定出的调控分蘖的关键基因,编码一个GRAS家族类转录因子,突变体moc1分蘖减少,过表达OsMOC1能增加分蘖(Li et al,2003)。OsMOC1与OsMOC3/WUSCHEL相互作用,激活OsFON1/CLAVATA,从而促进分蘖伸长(Shao et al,2019),与拟南芥WUSCHE-CLAVATA途径决定分生组织细胞增殖的作用相似(Sossich et al,2016)。水稻还存在抑制分蘖芽的伸长的基因FC1/OsTB1,编码一个TCP家族转录因子(Takeda et al,2003),它在玉米中的同源基因TB1是通过抑制分枝来确立顶端优势的株型关键驯化基因(Doebley et al,1997)。FC1/OsTB1的表达水平对几种植物激素包括独角金内酯、油菜素内酯、生长素、脱落酸和细胞分裂素的处理都有响应(Barbier et al,2019;Fang et al,2020;Gonzalez-Grandıo et al,2017;Minakuchi et al,2010;Wang et al,2018;Yao and Finlayson,2015)。其对糖和氮的响应是通过独角金内酯信号通路来实现的(Patil et al, 2022;Wu et al, 2020)。
之前,高位分蘖往往出现在孕穗期之后,生长期短,又因为与低位分蘖竞争有限的营养供应而被视为无效分蘖。随着再生稻(主要利用高位分蘖伸长获得再生季产量)在我国的大面积推广,研究发现,再生稻的产量潜力主要决定于最终的高位分蘖数(He et al,2023;Yu et al,2022)。因此,阐明高位分蘖伸长的分子机制,培育再生能力强的品种对再生稻产业的发展具有重要意义。之前研究发现,突变体topless2出现了高位分蘖伸长和数量增加现象(Yoshida et al,2012;Xia et al,2020)。OsTOPLESS2属于Groucho/Top1家族,编码转录抑制辅助因子。它与转录因子相互作用,并招募组蛋白去乙酰基酶(HDAC)使转录因子结合位点附近的染色质去乙酰化,压缩染色质结构,从而抑制下游基因表达(Ke et al,2015)。然而,关于它调控高位分蘖伸长的分子机制,目前尚不完全清楚。
在这项研究中,研究人员发现OsNL1是高位分蘖伸长的抑制因子,并提供了OsNL1与OsTOPLESS2互作后去招募去乙酰基酶,抑制下游基因OsMOC1/OsMOC3的表达,调控高位分蘖的伸长的分子证据。研究人员进一步揭示,HAN结构域中的VDCTLSLGT基序介导了OsNL1和OsTOPLESS2的互作。文章主要结果如下:


1.OsNL1调控高位分蘖的伸长

为了阐明高位分蘖伸长的调控机制,研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在粳稻品种kitaake中成功构建了一个突变体库。分离出一个与野生型相比增加了高位分蘖数的突变体nl1-1,其他农艺性状如株高、穗粒数、结实率、千粒重都发生了相应的改变(图1a,b;表S3)。值得注意的是,增加的分蘖主要来自于在野生型中通常处于休眠状态的第2节分蘖芽(图1c,d)。在由野生型和突变体杂交产生的F2分离群体中,表型符合3:1单基因隐性性状的分离比(67:29,χ2=1.125,P>0.05)。测序分析显示,OsNL1的第一个外显子(LOC_Os05g50270)上有4bp缺失(图1e)。敲除该基因的两个株系nl1-2和nl1-8都能重现高位分蘖伸长的表型(图S2-3)。所有这些结果都证实了OsNL1是调控突变体高位分蘖伸长表型的目的基因。调查OsNL1的时空表达情况发现,基因OsNL1主要在第二节分蘖芽中表达,在小分蘖芽中表达水平最高(<0.5 cm),随着分蘖芽的伸长,表达量逐渐减少(图1f)。GUS染色结果显示,蓝色染色主要分布在高位节间的分蘖芽中(图1g),证实了OsNL1的时空表达模式与高位分蘖伸长表型相对应。


图1:nl1突变体展示出高位分蘖增加且OsNL1在高位分蘖幼芽中高表达


2.HAN结构域介导了OsNL1与OsTOPLESS2的互作

之前在拟南芥的研究中发现,水稻 OsNL1的同源基因AtHAN/AtGATA18分别与AtTOPLESS1或AtTOPLESS2互作(Causier et al,2012)。因此,研究人员推测水稻中也存在OsNL1与OsTOPLESS2互作关系,并且协同调控水稻高位分蘖的伸长。利用酵母双杂,萤光素酶互补,BiFC和 Co-IP等分子实验技术,研究人员证实了OsNL1和OsTOPLESS2确实存在互作(图2a-d)。再利用系列的截短实验证实,这种互作依赖于蛋白OsNL1的HAN结构域(图2e)。进一步的体内Co-IP实验结果发现,HAN结构域中9个氨基酸基序VDCTLSLGT在OsNL1和OsTOPLESS2的互作中起着关键作用。


图2:HAN结构域介导OsNL1与OsTOPLESS2的互作


3.OsTOPLESS2参与水稻高位分蘖伸长

水稻中TOPLESS家族有3个成员OsTOPLESS1、OsTOPLESS2和OsTOPLESS3(Ma et al,2017)。通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验,证实OsNL1与这3个成员均能互作(图3a-c)。分别敲除这些基因发现,仅有OsTOPLESS2敲除突变体出现了高位分蘖数和总分蘖数增加的表型(图3d-g和S5),表明仅有OsTOPLESS2参与了高位分蘖伸长的调控。


图3:OsTOPLESS2突变导致高位分蘖数目增加


4.OsNL1与OsTOPLESS2相互作用抑制OsMOC1/3基因表达

鉴于OsTOPLESS2可以招募组蛋白去乙酰基酶(HDAC),影响下游靶基因的乙酰化水平的原理(Kagale and Rozwadowski,2011)。研究者利用乙酰化抗体H3K9ace进行ChIP-seq实验,筛选下游的靶基因。共鉴定出近千个组蛋白乙酰化水平在突变体nl1中升高的位点(表S2)。在这些位点中,OsMOC1是仅次于OsNL1的高富集度位点(图4a),表明OsMOC1可能是OsNL1的潜在靶基因。在水稻原生质体中进行的ChIP-qPCR实验证实,OsNL1可以直接结合OsMOC1启动子上(图4b)。EMSA结果表明,OsNL1与OsMOC1启动子上的基序GATC结合(图4c,d)。双萤光素酶检测发现OsMOC1的表达受到OsNL1的抑制(图4e,f)。突变体nl1中OsMOC1的表达水平和OsMOC1蛋白含量明显增加(图4g、h和S8)。由于双突变体nl1 moc1在总分蘖数和高位分蘖数方面与单突变体moc1相似(图4i-l和S10),表明了OsMOC1作用于OsNL1的下游。


图4:OsNL1通过OsMOC1调控高位分蘖的伸长

氨基酸基序替换的LUC实验发现,在9个氨基酸中,连续3个氨基酸的替换将削弱OsNL1对OsMOC1表达的抑制能力(图S9),表明VDCTLSLGT基序是参与OsNL1抑制功能的核心基序。


图5:OsNL1通过OsMOC3调控高位分蘖的伸长

先前的研究表明,OsMOC1与OsMOC3相互作用以调节分蘖伸长(Shao et al,2019)。研究人员在ChIP-seq结果中也发现,nl1突变体中OsMOC3启动子组蛋白乙酰化水平增加(图5a-5b)。EMSA实验和双萤光素酶实验证实,OsNL1同样结合OsMOC3启动子中的GATC基序并抑制其表达(图5c–f),在突变体nl1中,OsMOC3的表达水平明显增加(图5g)。遗传实验证实OsMOC3 也位于OsNL1基因的下游,moc3 nl1双突变体的分蘖数和高位分蘖数与moc3单突变体相似(图5h-k和S1)。所有这些结果表明,OsNL1及其辅助因子OsTOPLESS2互作之后,通过抑制OsMOC1和OsMOC3的表达,来调节水稻高位分蘖的伸长(图6)。


图6:水稻高位分蘖伸长调控机制的模式图

中国农业科学院作物科学研究所与西北农林科技大学联合培养博士生刘鑫、作科所已毕业博士张锋为论文共同第一作者,中国农业科学院作物科学研究所万建民院士、程治军研究员、西北农林科技大学赵惠贤教授为该研究工作的共同通讯作者。中国农业科学院作物科学研究所林启冰研究员,任玉龙研究员给予了意见与指导,博士生寻子琦,邵家乐,罗文凡,蒋小康,李帅及王家昌博士,王建博士提供了技术支持。研究工作得到了国家重点研发计划,中国农业科学院南繁专项计划的项目资助。


论文链接:https://doi.org/10.1111/pbi.14547


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