上海交通大学林开利、王旭东&徐州医科大学袁长永团队IM研究论文：3D生物打印双相多细胞活支架促进骨软骨缺损再生

X. Yu, M. Gholipourmalekabadi, X. Wang, C. Yuan, K. Lin. Three-dimensional bioprinting biphasic multicellular living scaffold facilitates osteochondral defect regeneration. Interdiscip. Mater. 2024; 3(5). doi: 10.1002/idm2.12181

随着人口老龄化和运动损伤发病率的上升，骨软骨缺损正在成为一个全球性的健康问题，带来巨大的社会和经济负担。大量研究表明，严重的关节损伤，如骨软骨缺损，极易引发老年人骨关节炎（OA）的发生。而关节软骨在损伤后自我修复能力有限。此外，由于骨软骨组织的复杂结构和组成，也给骨软骨再生带来了挑战。常用的骨软骨再生临床策略，包括自体软骨移植、微骨折、自体软骨细胞植入（ACI）干细胞注射，作用效果有限。这是由于缺乏有效的策略来重建包括软骨和软骨下骨的复杂多层功能组织结构。

近年来，仿生组织工程策略在复杂或多组织再生领域显示出巨大的应用潜力。在过去的几年中，生物3D打印技术因其在构建仿生组织方面的潜力而受到广泛关注。它能够精确整合各种组织细胞、生物材料和生物活性因子。由于这种多功能性，3D生物打印已被用于在体外进行许多复杂的组织，包括心脏、下颌骨、耳朵、肺、肌肉等等。因此，利用生物3D打印的优势，通过设计组织细胞的均匀分布，可以准确地模拟骨软骨组织的双层特征。然而，设计和开发能够模拟天然骨软骨结构、具有双重再生能力并实现复杂组织再生的多细胞生物3D打印支架仍然存在挑战。

在以往的研究中，为了模拟天然软骨及软骨下骨的特征，利用由上层水凝胶层和下层生物陶瓷或聚合物生物材料层组成的仿生支架来模拟骨软骨结构。然而，由于水凝胶、生物陶瓷和聚合物生物材料之间的机械性能、降解速率和其他特性的差异，修复后存在界面重建失败的风险。如果双相支架采用相同的基质材料，则可以促进骨-软骨界面的重建。GelMA水凝胶具有优异的生物相容性、生物降解性和细胞粘附性能，使其成为细胞3D培养和生物3D打印支架的理想载体。然而，纯GelMA的生物活性可能不足以实现骨软骨再生。因此，迫切需要开发用于生物打印应用的生物活性GelMA墨水。

研究表明，含锶（Sr）的生物材料对骨再生具有有益作用。课题组前期研究表明，用掺Sr硬硅钙石（Sr-CSH）改性的GelMA生物墨水可以有效促进骨缺损修复（Chemical Engineering Journal, 2022;433:132799.）。此外，含Sr的药物已被证明会抑制OA并促进软骨再生。因此，本研究提出GelMA/Sr-CSH可以作为双重调节生物墨水，同时调节软骨和骨再生。

另一方面，种子细胞是构建仿生组织的另一个关键因素。BMSCs在组织工程和再生医学领域引起了极大的关注。课题组新近研究证实，负载BMSCs的GelMA/Sr-CSH生物打印支架可以实现临界尺寸骨缺损的完全再生（Composites Part B, 2024;273:111256.）。因此，BMSCs适宜作为软骨下骨层的种子细胞。ACs是软骨组织工程的主要细胞来源；然而，ACs的体外扩增可能会引发去分化，从而可能降低其再生软骨组织的能力。BMSCs有望成为软骨组织工程的种子细胞来源。但是，BMSCs需要进行体外成软骨诱导分化，而诱导分化过程还可能诱发肥大和钙化。研究表明，当ACs与BMSCs共培养时，细胞间相互作用有助于维持ACs的软骨表型，同时促进BMSCs分化为ACs，从而有助于软骨再生。因此，ACs/BMSCs的共培养是再生关节软骨层的理想种子细胞。

基于上述背景，本研究成功设计了一种双重调节生物墨水，并在这项工作中利用生物3D打印技术制备了模拟骨软骨组织的双相多细胞支架。双相多细胞生物3D打印支架采用双层结构设计：上层软骨层为GelMA负载ACs/BMSCs，下层软骨下骨层为GelMA/Sr-CSH负载BMSCs。软骨层通过ACs和BMSCs的相互作用，维持ACs表型，同时促进了BMSCs成软骨分化。软骨下骨层通过Sr-CSH缓释生物活性离子，诱导各种细胞特异性分化，同时刺激软骨和软骨下骨再生。此外，GelMA（基质材料）作为连续相，避免界面分离，进而确保骨-软骨界面的良好重建。结果显示，双相多细胞生物3D打印支架表现出优异的细胞活性，有效调节ACs和BMSCs的特异性分化，显著加速大鼠骨软骨缺损一体化修复。

本研究受天然骨软骨结构的启发，采用双通道挤出生物打印技术成功制备了仿生骨软骨支架；通过设计具有双重调节功能的生物活性墨水，将来自不同谱系的细胞分层和封装，从而实现了双相支架生物学功能的空间特异性。本研究为生物3D打印技术在复杂组织再生领域的应用提供了一种可行策略。

图1 促进骨软骨再生的双相多细胞生物打印支架示意图。（A）生物3D打印技术制备双相支架。（B）双相支架植入骨软骨缺损。（C）骨软骨再生和界面重建。

图2 ACs和BMSCs的共培养促进体外软骨再生。（A）活/死染色。（B）成软骨相关蛋白（aggrecan和Col-II）的免疫荧光染色。（C-E）成软骨相关基因（SOX9、Col-II和aggrecan）的PCR分析。（F）ACs和BMSCs共培养对软骨形成影响的示意图。ACs和BMSCs的共培养促进体外软骨再生。

图3 Sr-CSH增强支架并改善GelMA的成骨活性。（A）GelMA/Sr-CSH诱导的BMSCs成骨分化示意图。（B）ALP染色。（C）ALP活性的半定量分析。（D）成骨相关蛋白（OPN）的免疫荧光染色。（E）钙结节的茜素红S染色。（F-J）成骨相关基因（OPN、OCN、BSP、BMP-2和Runx-2）的PCR分析。

图4 Sr-CSH调控ACs和BMSCs的分化。（A）BMSCs细胞增殖。（B）ACs细胞增殖。（C）BMSCs的ALP染色。（D）ACs的阿尔新蓝染色。

图5 双相多细胞生物3D打印支架促进体内软骨再生。（A）大鼠骨软骨缺损模型组织再生示意图。术后6周（B）和12周（C）缺损部位的照片和番红O/固绿（SO/FG）染色。术后6周（D）和12周（F）国际软骨修复学会（ICRS）评分。术后6周（E）和12周（G）基于Wakitani组织学评分标准的切片组织学分析评分。

图6 双相多细胞生物3D打印支架促进软骨下骨再生及体内骨软骨界面重建。术后6周（A）和12周（B）的CT图像以及苏木精和伊红（HE）染色。术后6周（C，E）和12周（D，F）的骨体积（BV）和骨体积分数（BV/TV）的定量分析。

林开利

博士、研究员、博士生导师，口腔颅颌面科副主任、上海市口腔医学重点实验室副主任。从事生物材料与组织再生、3D打印/生物3D打印与应用研究，兼任上海口腔医学会口腔材料专委会主任委员等。获中国科学院卢嘉锡青年人才奖，入选上海市优秀学科带头人、上海交通大学医学院双百人计划，连续4年（2020-2023）入选斯坦福大学发布的“年度全球前2%顶尖科学家”、“具有终身影响力的全球前2%顶尖科学家”榜单。历任16本中英文学术期刊副主编/编委/顾问编委等。主持2项国家重点研发课题、6项国家自然科学基金、9项上海市科委/卫健委项目；于Science Advances、Advanced Functional Materials、Biomaterials、Bioactive Materials、Interdisciplinary Materials等期刊发表一作/通讯SCI论文150余篇（18篇封面、50余篇IF>10）；发表论文被引次数>10600次（Web of Sciences^TM）；合著中英文专著8部；起草医疗器械行业标准4项、团体标准4项；获授权发明专利16项。

袁长永

博士、主任医师、副教授、硕士研究生导师。现任徐州医科大学口腔医学院副院长、徐州医科大学附属口腔医院（徐州市口腔医院）党委委员、副院长。担任中国整形美容协会口腔整形美容分会常务理事、中华口腔医学会口腔种植专委会委员、江苏省口腔医学会口腔种植专委会副主任委员、江苏省整形美容协会口腔颌面整形专业分会副主任委员。《Journal of Tissue Engineering》、《Stem Cell Research & Therapy》等杂志审稿专家。江苏省第五期和第六期“333高层次人才培养工程”第三层次培养对象、江苏省高层次卫生人才“六个一工程”拔尖人才。拥有专利9项，获批国家级课题1项、省级课题2项、市级课题4项。发表论文70余篇，其中SCI论文27篇。专业特长：擅长牙齿缺失后的即刻种植、前牙区美学种植、数字化微创种植、颌骨严重缺损的骨增量手术，以及全口多颗牙缺失的复杂种植。

王旭东

教授、主任医师、博士生导师。现任上海交通大学医学院附属第九人民医院副院长、国家口腔医学中心（上海）副主任、上海交通大学数字医学研究院副院长、中国医师协会口腔医师分会第六届委员会分会副会长、上海市儿童颅颌面畸形筛查诊治中心主任、德国国立杜易斯堡-埃森大学口腔医学院客座教授。从事疑难先天性或后天性牙颌面畸形的精准与微创治疗、数字医学与智能材料研究。主持国家及省部级项目15项，发表论文100余篇，授权专利60余项（16项完成转化），出版专著11部。入选上海市优秀学科带头人、上海市科技启明星、优秀青年医学人才计划，荣获银蛇奖(提名奖)、张江国家自主创新示范区杰出创新创业人才、上海市育才奖、宝钢优秀教师奖等荣誉称号。

余幸鸽

同济大学口腔基础医学博士，上海交通大学医学院附属第九人民医院住院规培医师、博士后。主要从事生物3D打印在组织再生中的应用研究，已在Bioactive Materials、Chemical Engineering Journal、Composites Part B、Interdisciplinary Materials等期刊发表一作/通讯作者SCI论文5篇。