引用本文：齐洪梅, 张莉, 杜满, 等. 刚毛黑孢壳菌感染致真菌性角膜炎1例[J]. 中华眼科杂志, 2024, 60(2): 176-179. DOI: 10.3760/cma.j.cn112142-20231024-00168.
患者男性，66岁。2021年1月右眼被木板崩伤后眼红伴视物不清，畏光、流泪，就诊于当地医院，诊断为“角膜炎”，给予0.3%妥布霉素滴眼液、更昔洛韦凝胶、氟康唑滴眼液等进行治疗后病情未见好转。患者于2021年3月2日来山东第一医科大学附属眼科医院就诊，主诉右眼眼红、眼痛。体检：一般状况良好，既往身体健康，无系统性疾病。眼科检查：裸眼视力右眼0.3，左眼0.6。眼压：右眼12 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），左眼18 mmHg。裂隙灯检查法观察到右眼结膜充血、水肿，角膜中央可见约4 mm×4 mm浸润灶，伴表面白色苔被附着，拟诊为真菌性角膜炎（ 图1 ）。共聚焦显微镜检查可见右眼病灶区扫描可见大量菌丝，粗细不均，浸润深度约90 μm（ 图2 ）。对角膜溃疡灶进行刮片，荧光白染色后进行显微镜下观察，可见较多分隔分枝菌丝，大量厚壁孢子，间生或端生，单个或成串（ 图3 ）。角膜刮取物接种于沙氏葡萄糖琼脂（Sabouraud′s dextrose agar，SDA），培养3 d后进行形态学鉴定（ 图4 , 5 , 6 ），初步鉴定结果为尖端赛多孢霉，但镜下形态与尖端赛多孢霉有所不同，故又进行内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）基因测序进一步鉴定：采用引物ITS1∶5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4∶5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′进行基因扩增。测序结果经BLAST软件比对，与刚毛黑孢壳菌（ Petriella setifera）（GenBank NO.AY882349.1）相似度为100%，结合形态学特点鉴定结果最终为刚毛黑孢壳菌。诊断为右眼刚毛黑孢壳菌感染致真菌性角膜炎。
裂隙灯检查法观察右眼被木板崩伤后眼红伴视物不清患者右眼前节情况，可见结膜充血，角膜中央可见4 mm×4 mm浸润灶，伴菌丝苔被共聚焦显微镜观察右眼被木板崩伤后眼红伴视物不清患者右眼角膜病灶区，可见大量菌丝，粗细不均 ×400光学显微镜下观察右眼被木板崩伤后眼红伴视物不清患者右眼角膜病灶刮片，可见较多分支分隔菌丝，大量圆形或椭圆形厚壁孢子 荧光白染色 ×400光学显微镜下观察右眼被木板崩伤后眼红伴视物不清患者右眼角膜病灶刮片，可见椭圆形至圆柱形分生孢子 荧光白染色 ×1 000右眼被木板崩伤后眼红伴视物不清患者角膜刮取物沙氏葡萄糖琼脂培养基培养后不同时间的菌落 5A示培养5 d后；5B示培养12 d后光学显微镜下观察右眼被木板崩伤后眼红伴视物不清患者SDA培养基角膜刮取物沙氏葡萄糖琼脂培养基培养12 d后的真菌结构 ×400 6A示未成熟的子囊壳；6B示成熟的子囊壳，6C示孢囊束
采用微量稀释法（美国临床实验室标准化协会制定的M38-A3方案）进行体外药物敏感性试验，质控菌株为近平滑念珠菌（ATCC22019）。两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、米卡芬净、卡泊芬净和阿尼芬净对刚毛黑孢壳菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations，MIC）分别为4、32、1、0.5、1、>8、>8和>8 μg/ml。目前尚未有抗真菌药物对黑孢壳属的折点数据，故无法判读是否敏感，但是药物敏感性试验结果显示，伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑对该菌的MIC较低，两性霉素B、氟康唑则表现出中等的MIC，米卡芬净、卡泊芬净和阿尼芬净等棘白菌素类表现出较高的MIC。
根据临床经验给予角膜清创联合抗真菌和抗炎治疗：氟康唑滴眼液20 min 1次，那他霉素滴眼液1次/h，普拉洛芬滴眼液4次/d，加替沙星滴眼液4次/d，加替沙星眼用凝胶每晚睡前1次。随访期间病情持续好转，3周后裂隙灯检查法可见角膜基质浸润减轻，上皮基本愈合，抗真菌药物减量继续使用。40 d后患者自诉病情明显好转，裂隙灯检查法可见角膜基质变薄，上皮基本愈合（ 图7 ）；共聚焦显微镜下未发现病灶内明显的菌丝结构。患者视力有明显改善，裸眼视力提高到0.6，随访期内未见复发。
裂隙灯检查法观察右眼刚毛黑孢壳菌感染致真菌性角膜炎患者抗真菌治疗后右眼前节情况，可见角膜上皮基本愈合
讨论
刚毛黑孢壳菌隶属于小囊菌目、小嚢菌科、黑孢壳属，是一种常见于土壤和粪便中的真菌，也存在于腐木、植物和堆肥上 ［ 1 , 2 ］ 。德国学者Schmidt于1912年在马粪中首次发现该菌，将其归为微曲霉的一种。1962年被正式命名为刚毛黑孢壳菌。
真菌性角膜炎的主要病因为植物性角膜外伤，患者以农民居多，春种秋收时发病率较高 ［ 3 , 4 , 5 , 6 ］ ，主要的致病菌为镰刀菌属、曲霉菌属和链格孢霉属等 ［ 6 , 7 ］ 。目前未见刚毛黑孢壳菌导致人类角膜感染的报道，导致人类其他部位感染的病例仅见Cerne等 ［ 8 ］ 报道的1例刚毛黑孢壳菌皮肤感染，该男性患者因甲板碎木片损伤腿部皮肤引发感染，致病菌最初被鉴定为赛多孢霉属，但发现两者形态并不完全相同，后经基因测序鉴定为刚毛黑孢壳菌，与本例患者同样是因木材导致的外伤后局部组织感染，说明腐木上存在该菌可能有普遍性。系统发育学研究结果表明，黑孢壳属与赛多孢霉属和节荚孢霉属有着密切的亲缘关系 ［ 1 , 2 ］ ，因此在形态上具有许多相似的地方。本文中最初对病原菌的形态学鉴定结果也是尖端赛多孢霉，说明两者在形态上非常容易混淆，但是经过仔细观察后发现，无论菌落还是镜下形态都有差异。现将两者异同点总结如下：在SDA培养基上初期两者的菌落颜色相近，均为灰白色，但是随着时间的延长，刚毛黑孢壳菌的菌落变为深黑色，出现很多黑色颗粒，且可见因菌落侵蚀琼脂出现的培养基放射状沟纹和皲裂。镜下分生孢子形态、大小，黏束孢产孢均相似，但是尖端赛多孢霉的分生孢子梗只有环痕产孢的方式，而刚毛黑孢壳菌分生孢子梗的顶端为环痕产孢，分生孢子梗周边的产孢点可以直接产孢，无柄或小齿，仅留一疤痕。体外培养5~7 d，菌落中会产生子囊壳，子囊壳周边具有刚毛，有1个或多个开口，待成熟后释放出橙红色的子囊孢子。由于初期镜下观察菌丝形态时采用棉兰染色的方法，在粘取标本时会破坏产孢结构的原始形态，给形态鉴定增加了一定难度，因此笔者建议：（1）观察镜下产孢方式，孢子的排列方式宜采用小培养；（2）适当延长真菌的培养时间，待出现特征性结构会增加真菌形态鉴定的正确率；（3）对于罕见真菌应通过基因测序进行鉴定。
由于相关报道罕见，故抗真菌药物对刚毛黑孢壳菌的药物敏感性数据以及临床治疗经验都非常匮乏。本文药物敏感性试验结果与Cerne等 ［ 8 ］ 的结果基本一致，伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑对该菌的MIC较低，两性霉素B和氟康唑MIC中等，棘白菌素类药物则表现出较高的MIC。Cerne等 ［ 8 ］ 报道的病例通过皮肤病灶切除联合口服药物治疗，最终治愈，其过程是初始使用口服伏立康唑200 mg 2次/d，但是不久后由于患者服药后产生幻觉，更换为口服泊沙康唑300 mg 1次/d，持续8周治愈，说明泊沙康唑对该菌引起的皮肤感染治疗有效，与药物敏感性试验结果相符。本文因为最初根据经验给予的氟康唑和那他霉素对患者有效，所以治疗过程中并未更换抗真菌药物，直至治愈，说明氟康唑与那他霉素联合使用对该菌引起的角膜炎可能有效。由于各种原因，对真菌性角膜炎局部使用抗真菌滴眼液治疗时，限于药物浓度和穿透性低，很难达到较好的治疗效果，联合角膜清创术对增加通过性，增强药物性能，对于缩短治疗周期具有重要意义 ［ 5 ， 9 , 10 , 11 ］ 。刚毛黑孢壳菌虽与尖端赛多孢霉形态相似，亲缘关系密切，但是两者对抗真菌药物的耐药性却相差很大 ［ 12 ］ ，临床治疗用药也有很大区别，尖端赛多孢的耐药性更加强，治疗更加困难，因此，菌种的正确鉴定和药物敏感性试验结果对疾病的治疗具有重要的意义。该病例的诊断过程也充分展现了分子生物学技术在眼部感染环境真菌鉴定中的重要作用。
