2024 年 6 月 24 日，中国农业大学农学院小麦研究中心在 Plant Communications 杂志上在线发表了题为 "lcQTH: rapid quantitative trait mapping through tracing parental haplotype with ultra-low-coverage sequencing" 的研究论文。该论文提出了基于超低深度重测序技术实现作图群体的双亲单倍型解析、重组景观图谱构建和基于单倍型QTL精准定位的方法——lcQTH。相比于芯片和重测序技术，lcQTH方法可以将作图群体的基因型检测成本控制在万元（人民币）左右，且有效标记数量显著提升、标记密度在全基因组分布均匀；相比于混池测序，lcQTH策略对于多表型的关联位点挖掘具有显著优势，同时支持对优异基因聚合单株或剩余杂合系的辅助筛选。该方法目前已应用多个重组自交系（RIL）中，为加速基因图位克隆、发掘优异单倍型、辅助单株筛选提供了新工具。
构建人工构建的双亲RIL群体等作图群体是目前进行功能基因图位克隆的重要手段。虽然高通量测序的成本已经降低到10元/G，然而对群体每个品系进行全基因组重测序的成本仍然很高。SNP芯片因其成本较为低廉（50K SNP芯片检测成本约200~250元/样）成为在群体水平进行基因型鉴定的常用方案，但仍存在有效SNP数量少、标记分布不均衡、结构变异鉴定能力有限等缺点。基于混池测序的方法（如BSA、BSR）也是基因定位中常用的基因分型手段，该类方法需要对极端表型个体分别构建混合池进行测序，并通过比较多态性位点的等位频率的差异进行区间定位。然而，混池测序方法依赖于对表型的准确考察，难以获得个体基因型，且每次混池仅能适用研究单一性状、分析成本随着性状数量的增加而快速增加（图1）；该类策略和多维表型数据的结合能力存在局限。
图1 不同基因分型策略的成本对比
在前期已建立的基于重测序数据对种质资源单倍型进行精准解析方法（Yang, et al, 2022）的基础上，该研究建立了统计学模型实现利用超低深度测序数据对作图群体进行单倍型溯源（图2），显著降低了单样本基因分型的成本。以小麦（基因组大小为16Gbp）为例，仅需0.1×测序量（~1.6G/样本，价格为50~60元/样），即可实现50Kbp分辨率的双亲单倍型分型。对于200个品系的作图群体来说，实现所有个体的重组分型总价在1.5万元（人民币）以内。以这些均匀分布的单倍型做标记，可以实现任意表型性状的快速定位。同时，结合亲本重测序数据，该策略可以识别双亲单倍型间的结构变异。
图2 lcQTH方法基本流程
为了验证lcQTH策略在实际基因定位的应用效果，研究以260余份小麦RIL系（农大3097 × 轮选987）为例，对穗长性状等性状进行了基因定位。研究中首先对RIL系各个品系进行了超低深度测序（图3A），并利用lcQTH进行双亲单倍型分型。分析表明可在50Kbp分辨率下实现对RIL系中发生重组位点的判定（图3B）。表型分析显示，双亲在穗长上存在极显著差异，且RIL系穗长呈近似正态分布（图3C），以单倍型为标记结合QTL作图方法进行了基因定位，在4B染色体上发现了一个LOD值大于11的信号峰（图3D）。利用重组图谱筛选在该QTL区间内存在重组的RIL材料，结合对应表型将候选区间进一步缩减到1.7Mbp区间（图3E）。通过提取双亲间该区间的序列变异，发现农大3097（ND3097）在该区间内存在一个约500Kbp的片段缺失，恰为此前报道的重要矮杆基因Rht-B1的r-e-z等位基因（Song等，2023）。同时，另一个亲本轮选987携带的则是Rht-B1b类型等位基因（图3F）。和Song等的研究结果一致，携带r-e-z单倍型的材料相较于携带Rht-B1b的具有更长的穗长（图3G）。上述结果表明，利用lcQTH可实现候选基因的快速精确定位，同时有能力解析和表型关联的结构变异，为实现候选基因的定位与遗传解析提供了有力工具。
图3 在农大3097 × 轮选987重组自交系群体中
利用lcQTH对穗长基因进行定位
综上所述，该研究建立了基于超低深度测序数据对作图群体进行单倍型重组景观构建和QTL作 图分析的方法流程（lcQTH），并证明其具备有效降低群体的基因分型成本、加速基因定位挖掘、辅助功能变异解析和单株筛选的能力。该方法具备推广至多亲群体的潜力，为作物功能基因发掘和分子设计育种提供了新思路。该研究工作也展现了超低深度测序在作物遗传资源解析与挖掘利用方向的巨大潜力。
中国农业大学农学院小麦研究中心 郭伟龙 副教授为该论文的通讯作者，博士生 王文熙 为第一作者。小麦研究中心 孙其信 院士、倪中福 教授、宿振起 教授、彭惠茹 教授、刘杰 教授对该工作进行了指导和帮助；研究生 陈哲、杨正钊、刘继鲁 和博士后 王梓豪 参与了该工作。该工作得到了科技创新2030和国家重点研发计划项目的支持。感谢中国农业大学超算平台的技术支持。本工作中相关创新方法已申请发明专利。 |
藏粮于地、藏粮于技，作物科学是农业发展的关键。为促进作物领域科技创新进展交流，加强创新人才培养，弘扬学科优秀文化，推动现代农业高质量发展，在国内兄弟单位大力支持下，中国农业大学农学院牵头创立“作物科学联盟”公众号，旨在搭建作物科学领域创新思想的交流平台，弘扬科学家精神，传播科技兴农的新理念、新技术、新产品，引领全国作物学学科的创新与发展。
