"怀长期主义，聊医工科技"
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| 今天的文章中，超哥为大家介绍一种创新的基于聚焦超声（FUS）的机械遗传学系统，称为CaDox，可通过非侵入性方式高效引导固体肿瘤的基因表达。CaDox利用FUS触发癌细胞的钙信号传导，并结合四环素响应的遗传电路，使肿瘤内亚群细胞表达CD19抗原。随后，这些细胞充当“训练中心”，激活SynNotch CAR T细胞，利用其识别并攻击广泛表达的肿瘤抗原PSMA，从而杀灭整个肿瘤区域。实验在体外3D类器官和体内小鼠模型中验证了CaDox的安全性与高效性。结果显示，CaDox系统可精确控制基因表达，显著减少背景噪声，且无非靶向组织损伤。结合CAR T疗法，该技术解决了传统治疗中肿瘤异质性和抗原特异性不足的难题。该研究展示了FUS与免疫疗法的结合潜力，为固体肿瘤治疗提供了一种非侵入式、高精度且安全的新方法。 |
HIFU最新应用：机械聚焦超声M-HIFU与免疫疗法检查点抑制剂结合开启肿瘤治疗新方法
超声组学 + Sonazoid造影剂：113名患者实证的肝癌免疫标志物预测研究
固体肿瘤治疗中的挑战在于异质性和靶向特异性抗原的缺乏。本研究开发了一种基于聚焦超声（FUS）的机械遗传学系统，称为CaDox，该系统结合钙信号传导和四环素响应基因回路，以实现高时空精度的肿瘤基因引导。该技术可激活癌细胞表达CD19抗原，将其作为“训练中心”，进一步引导SynNotch CAR T细胞靶向杀死肿瘤中的异质癌细胞群体。
聚焦超声（FUS）诱导前列腺癌PC-3细胞的钙反应 (A) 聚焦超声刺激装置的示意图，该装置集成在倒置荧光显微镜中，用于监测FUS刺激下的实时钙动态变化。(B) 代表性图像显示加载了钙荧光探针Fluo-4 AM的PC-3细胞在FUS刺激下的细胞内钙反应。橙色虚线圆表示换能器的焦点区域（120 µm）。比例尺：100 µm。(C) 位于FUS焦点区域的每个细胞内钙水平的时间变化曲线（灰线），黑线表示平均值。(D) 利用荧光素酶测量存在和不存在超声暴露时培养基中的ATP水平（n=3）。(E) 短脉冲重复FUS刺激引发的钙反应：每5分钟刺激1分钟，共六次循环。(F) 类器官实验设置的示意图，在培养皿中生成表达R-GECO1的稳定PC-3细胞类器官。(G) 2-MHz FUS刺激下类器官细胞的钙响应曲线，FUS刺激时间为60秒至120秒。误差线表示标准误（SEM）。(H) 从PC-3细胞衍生类器官的钙反应代表性时间序列图像。比例尺：50 µm。
研究方法与技术创新
a. 机械感应与钙响应
使用FUS刺激癌细胞，通过机械扰动诱导细胞内钙信号反应。PC-3前列腺癌细胞在2D和3D模型中表现出显著的钙反应，通过ATP释放引发相邻细胞的钙波传播。
CaDox系统的开发与表征 (A) 使用与NFAT直接融合的EGFP追踪NFAT在重复FUS刺激下的位移。比例尺：10 µm。(B) 钙和四环素共同门控的遗传电路示意图，称为CaDox系统。(C-D) 不同NFAT变体在与钙调蛋白（CN）结合力不同情况下的位移时间曲线（C）和图像（D）。实验中在2分钟加入ATP（60 µM）诱导钙水平升高，并在7分钟洗去ATP。样本数n=5。(E) CaDox系统由CaDox调节器和CaDox报告器组成。(F) 在诱导剂ionomycin（1 µM）作用下，CaDox调节器的位移过程。(G) 使用萤火虫荧光素酶（Fluc）作为诱导型报告基因，海肾荧光素酶（RLuc）作为参考基因，对CaDox系统的基因表达进行定量分析。样本数n=3。(H) 在有无ionomycin的情况下，滴定四环素浓度对CaDox系统的响应影响。样本数n=3。统计显著性通过t检验确定。(I-J) PC-3细胞中使用mCherry作为报告基因的CaDox系统在不同处理条件下的代表性图像（I）和定量分析结果（J）。比例尺：100 µm。样本数n=31。误差线表示标准误（SEM）。除非另有说明，统计显著性通过ANOVA和Tukey多重比较检验确定。
b. 体外与体内验证
体外实验中，利用PC-3细胞构建三维类器官，验证CaDox系统在钙信号与FUS机械刺激下的基因诱导能力。体内试验则通过移植模型小鼠验证FUS引导基因表达的安全性和效果。
基于FUS的机械遗传学系统在3D类器官模型中的应用 (A) 类器官生成、激活和成像的示意图。使用表达CaDox-mCherry的PC-3细胞生成类器官。(B-C) 来自稳定表达CaDox-mCherry系统的PC-3细胞类器官的代表性图像（B）和定量分析结果（C）。图中显示了不同处理条件下的类器官表现，包括：未处理组（n=10）、仅FUS处理组（n=5）、仅四环素处理组（n=12）、以及联合处理组（n=13）。比例尺：50 µm。误差线表示标准误（SEM）。统计显著性通过ANOVA和Tukey多重比较检验确定。
c. 与免疫疗法整合
将CaDox系统与SynNotch CAR T细胞联合，诱导表达CD19抗原的肿瘤细胞训练CAR T细胞，利用PSMA抗原攻击整片肿瘤区域，实现高效杀伤并减少脱靶毒性。
基于FUS的机械遗传学系统的体内表征 (A) 自制小动物FUS刺激系统的示意图。用户可通过Python代码定义刺激模式和超声参数，控制FUS电子设备、函数发生器和功率放大器，以将信号传递至FUS换能器。在30分钟刺激窗口中，使用针式温度计监测聚焦区域的温度变化。(B) 使用水听器测量的1 MHz换能器在聚焦点的二维波束分布图。(C) 温度计在肿瘤部位的读数表明FUS刺激期间温度波动小于1℃。(D) 声波传播路径及动物体内机械应力分布的仿真结果。仿真模拟了包含皮肤层（厚0.5 mm）、肌肉层和嵌入肌肉层内的肿瘤（3 mm x 3 mm x 1.8 mm）的动物体环境。(E) FUS激活CaDox系统的体内实验设计。将PC-3-CaDox-NLuc细胞注射至NSG小鼠体内建立双侧肿瘤模型。在第5天，对肿瘤分别施加四环素、FUS或联合处理，利用生物发光成像（BLI）监测24小时内荧光素酶活性的变化。(F) 显示基因表达的BLI代表图像，分别为未处理组和联合四环素与FUS处理组的皮下肿瘤图像。(G) 不同处理下24小时内皮下肿瘤基因表达的归一化倍增变化（n=4）。每种处理条件下的基因表达均归一化至未处理组以便于准确比较。误差线表示标准误（SEM）。统计显著性通过配对t检验确定。联合四环素与FUS处理与仅四环素处理的比较在6小时、12小时和24小时分别得到p值为0.0098、0.0033和0.0003的显著性差异。
d. CaDox系统设计
设计基于AND逻辑门的遗传电路，利用NFAT和反向四环素转录激活因子（rtTA）融合蛋白控制基因表达，仅在钙信号与四环素存在下共同激活。通过优化NFAT结合位点提高基因转录效率，同时降低背景噪声。
联合免疫治疗策略的示意图 该图解展示了提出的治疗方法，包括以下步骤：基因递送：将CaDox系统递送至肿瘤，用作肿瘤疫苗。局部激活：通过聚焦超声（FUS）刺激局部激活CaDox系统，对肿瘤进行预处理，诱导部分肿瘤细胞表达经过临床验证的特异性抗原。免疫识别与杀伤：SynNotch CAR T细胞识别这些可诱导的抗原，随后表达针对强效且广泛肿瘤抗原的CAR，并杀死肿瘤部位的整个癌细胞群体。
研究结果与应用前景
高效基因引导：CaDox系统在钙信号和四环素共同刺激下实现了明确的基因表达，显著减少背景噪声。
精准肿瘤靶向：SynNotch CAR T细胞在CD19阳性肿瘤细胞引导下，精准识别并杀伤携带PSMA抗原的肿瘤细胞，解决了异质性肿瘤的治疗难题。
安全性验证：体内实验中未观察到组织损伤或非靶向效应，验证了FUS-CaDox系统的安全性。
研究意义
该研究开创性地将FUS与机械遗传学结合，为固体肿瘤的免疫治疗提供了一种非侵入式、高时空精度的解决方案。通过诱导抗原表达和CAR T细胞“训练中心”，该技术有望显著提升肿瘤治疗的特异性和效率。
参考文献
Yoon, Chi Woo, Chunyang Song, Dung Ngo Minh Nguyen, Linshan Zhu, Phuong Ho, Ziliang Huang, Gengxi Lu et al. "Tumor Priming by Ultrasound Mechanogenetics for with SynNotch CAR T Therapy." bioRxiv (2024): 2024-10.
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我是超哥，超声行业17年老伙计，做过研发，搞过生产，趟过市场，开过（在开）公司；越野跑爱好者；工作狂；沟通粗暴直接；严苛完美主义者；起伏皆为过往；信奉长期主义和第一性原则；欢迎来聊来组局...
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