摘要：肠毒素佐剂因其增强共同传递抗原的免疫应答能力而得到研究。然而，除了霍乱疫苗外，这些蛋白质尚未包含在任何当前批准的疫苗中。它们包括来自霍乱弧菌的细菌毒素、霍乱毒素或大肠杆菌的热敏毒素，例如解毒的突变体或亚单位。这类佐剂的特点是其多种递送可能性，包括肌肉注射、皮肤应用或通过口服、舌下或鼻腔途径的直接粘膜给药。此外，肠毒素佐剂的加入与疫苗接种后多方面的细胞和体液免疫反应的发展相关。在这里，我们回顾了过去几年在临床试验的安全性和有效性、临床前疫苗研究以及肠毒素佐剂的新机制见解方面的激动人心的进展。这包括了它们在针对微生物感染（细菌、病毒、寄生虫）或药物滥用的疫苗中的应用的最新报告。
介绍：本综述的目的是确定源自霍乱毒素（CT）或大肠杆菌热敏毒素（LT）的肠毒素蛋白佐剂的最新进展。正如过去的综述所强调的，这一努力始于20世纪70年代细菌蛋白毒素的纯化。从那时起，就它们作为疫苗佐剂的使用进行了大量的研究。在这里，我们利用2019年至2023年5月的PubMed搜索文章“肠毒素佐剂”，并进行次级搜索“dmLT”、“LTh(αK)”、“LTA1”和“CTA1-DD”以确定50篇最相关的引文。我们描述了这些新研究如何推进临床疫苗、临床前疫苗设计，以及/或者提供了有关佐剂使用（包括图1所示）的机制见解，这些蛋白质具有AB5结构，具有酶活性的A亚单位和细胞结合的B亚单位，结合分子修饰以优化疫苗的安全性和有效性（见图2）。
临床疫苗进展表明，与早期研究相比，肠毒素佐剂的安全性和有效性有所提高
在下面描述的疫苗之前，使用肠毒素佐剂成分的临床试验在很大程度上因安全问题而失望。特别是，与口服给药相关的液体分泌或在鼻腔给药LT或早期的遗传解毒LT佐剂（LTK63）之后的面部瘫痪（贝尔氏麻痹）有关。在这里，我们展示了随后开发的LT佐剂的激动人心的临床进展，特别是通过替代给药途径给予的dmLT佐剂。这种佐剂以LT的A亚单位中的双突变（LT(R192G/L211A)）命名。新的临床疫苗试验结果利用了通过口服（p.o.）、皮内（i.d.）和肌肉内（i.m）途径给予的dmLT佐剂。最近报告了七项临床试验，使用dmLT在肠毒性大肠杆菌（ETEC）疫苗中，包括活减毒、灭活或亚单位抗原配方或在脊髓灰质炎疫苗中与Salk灭活病毒抗原联合使用。一个灭活的AB5分子，LTh(αK)，最近也通过鼻内（i.n.）给药进行了测试，尽管关于这个分子知之甚少。这些研究提供了令人鼓舞的早期安全性和耐受性数据，以及增强免疫原性和/或疾病保护的有希望的报告，如表1所总结。
口服ACE527和dmLT佐剂展示对肠毒性大肠杆菌的保护效果
ACE527是一种多价活减毒疫苗，由三种遗传减毒和工程化的大肠杆菌菌株组成，具有覆盖表面定植因子抗原（CF，例如CFA/I、CFA/II和CFA/IV）的抗原谱，并且还表达LT B亚单位。在一项对照的H10407 ETEC挑战研究中，单独给予三个ACE527口服剂量（2×10^11菌落形成单位（cfu））或与25微克的dmLT结合。
口服ACE527和dmLT佐剂展示对肠毒性大肠杆菌的保护效果
ACE527是一种包含三种遗传减毒和工程化大肠杆菌菌株的多价活减毒疫苗，其抗原谱覆盖表面定植因子抗原（CF，例如CFA/I、CFA/II和CFA/IV），并且也表达LT B亚单位。在一项针对H10407 ETEC的控制挑战研究中，给予三个ACE527口服剂量（2×10^11菌落形成单位(cfu)），单独或与25微克dmLT结合。
图2《免疫学当前观点》 来自含肠毒素疫苗的保护性免疫涉及佐剂、给药途径和抗原形式之间的相互作用。对肠毒素佐剂进行的正在进行的临床、临床前和机制评估的总结。在疫苗设计中，肠毒素佐剂的使用具有相当的灵活性。这包括选择与适当或最佳粘膜和系统给药途径配对的肠毒素佐剂，以及疫苗抗原。这些相互作用的组合负责使用动物或人类挑战研究定义生成保护性免疫。然而，疫苗配方并没有“放之四海而皆准”的方案，保护的基础因素（例如粘膜或系统CD4 T细胞、Th17细胞、B细胞、IgG、IgA等）也各不相同。因此，虽然肠毒素佐剂可以推动疫苗效果，但保护性免疫的性质仍然是疫苗和疾病特定的。在动物和人类研究中的新报告已经确定了这一类佐剂以前未报告的安全性和有效性，特别是对于突变佐剂dmLT。图表使用Biorender.com制作。
表1 肠毒素佐剂的最新临床进展
a 病原体/抗原（s） 佐剂 佐剂剂量（s） 途径 地点 受试人群 试验设计 佐剂安全性 主要免疫学发现 参考文献 ETEC：活减毒（ACE527） dmLT 25.0 μg 口服 美国（马里兰州巴尔的摩）60名成人（第A部分），57名成人（挑战） 第I/II期双盲、安慰剂对照随机对照试验；3剂ACE527有或没有dmLT与安慰剂；ETEC菌株H10407挑战接种后6个月（NCT01739231） 安全且耐受性良好；dmLT组轻度胃肠道症状增加（胀气） dmLT减少排泄，增加血浆抗体反应（无显著性），挑战后保护效果从23.1%（单独ACE527）提高到65.9% ETEC：全灭活（ETVAX） dmLT 10.0 μg 口服 孟加拉国达卡 45名成人 第I/II期双盲、安慰剂对照、剂量递增和年龄递减随机对照试验；2剂ETVAX，有或没有dmLT与安慰剂（NCT02531802） 安全且耐受性良好 增加对O78 LPS和蛋白CFs的血浆抗体反应（含量最低的CS5、CS6）；增强血浆抗体反应的抗原广度 ETEC：全灭活（ETVAX；½, ¼,1/8成人剂量） dmLT 2.5 μg 5.0 μg 10.0 μg 口服 孟加拉国达卡 430名儿童和婴儿 第I/II期双盲、安慰剂对照、剂量递增和年龄递减随机对照试验；2剂ETVAX，有或没有dmLT与安慰剂（NCT02531802） 安全且耐受性良好 在最小年龄组（6–11个月婴儿）中增强并扩大对蛋白抗原和078 LPS的粘膜免疫反应；支持剂量减少 ETEC：亚单位（CssBA） dmLT 0.1 μg 0.5 μg 肌肉注射 美国（华盛顿特区） 50名ETEC-naive成人 第I期开放标签试验，3剂CssBA单独（5 mg），dmLT单独（0.1 mg），或CssBA（5, 15, 和 45 mg）+ dmLT（0.1 和 0.5 mg）（NCT03404674） 无SAE；注射部位变化（红斑，硬化和瘙痒）和系统性（松散的粪便，HA和肌肉痛） 剂量依赖性增强系统免疫反应（血清IgG，IgA和抗原特异性B细胞）；诱导强大的抗LT反应 脊髓灰质炎病毒：灭活（fIPV） dmLT 0.47 μg 皮内注射 美国（佛蒙特州伯灵顿）29名IPV接种成人 第I/II期双盲、主动对照随机对照试验；单剂量fIPV有或没有dmLT（NCT03922061） 无SAE；耐受性良好；注射部位变化（瘙痒，色素沉着和硬化） 增加对所有三种脊髓灰质炎病毒血清型的血清中和抗体反应；两研究组均未检测到粪便抗体反应 [8] 脊髓灰质炎病毒：灭活（IPV） dmLT 0.5 μg 肌肉注射 比利时 90名IPV接种成人 第I期双盲随机对照试验；单剂量IPV单独（n = 32），IPV + dmLT（n = 33），或bOPV1,3（n = 22）（NCT04232943） 无SAE；耐受性良好，dmLT轻微增加系统性不良事件（疲劳，HA）；局部反应无差异 通过第28天bOPV1,3挑战后检测到的粪便抗体和病毒脱落，系统性或粘膜反应无差异流感：亚单位（三价HA） LTh(αK) 30.0 μg 45.0 μg 鼻内 台湾 354名健康成人（20–70岁） 第II期多中心、双盲随机对照试验；第1天和第8天接种2剂，有或没有佐剂（NCT03784885） 安全且耐受性良好；在更高佐剂剂量组中，不良事件（包括腹泻）略有增加 增强鼻分泌型IgA产生；在较低佐剂剂量下抗体反应最高
a 缩写：双突变热敏肠毒素（dmLT）、随机对照试验（RCT）、分数剂量IPV（fIPV）、脊髓灰质炎病毒血清型2（PV2）、双价口服脊髓灰质炎疫苗1和3（bOPV1,3）、不良事件（AE）、严重不良事件（SAE）。
(clinicaltrials.gov identifier NCT0173923 ). dmLT将中度至重度腹泻的攻击率从67.7%（对照组）降低到23.1%，并显著提高了疫苗效力至65.9% (p = 0.003)。这是与之前ETEC挑战研究相比的显著改进，在之前的研究中，使用较高剂量的ACE527（2×10^11 cfu）报告了显著的副作用（恶心和腹泻），保护效力仅为27%。
口服ETVAX与dmLT蛋白佐剂在所有年龄组中展示有希望的安全性和免疫原性
ETVAX是一种灭活ETEC疫苗配方，过度表达最普遍的细菌CFs和一种类毒素（LCTBA）。在早期研究中，ETVAX结合dmLT在健康的瑞典成人中表现良好（2009年报告），最近首次在低收入和中等收入国家的儿童和婴儿中完成了一项大型的年龄递减试验（NCT02531802 ）。dmLT在所有年龄组中安全且耐受性良好。有趣的是，免疫学评估揭示了系统性和粘膜免疫反应的强烈年龄依赖差异，婴儿（6–11个月）显示出最低的反应[4–6]。在粪便提取物中更普遍检测到分泌型（s）IgA反应。dmLT增强了ETVAX蛋白抗原（CFs和LTB）以及078脂多糖（LPS）的粘膜抗体反应的幅度和广度。这支持dmLT在抗原剂量减少方面的作用，特别是在关键目标人群中最年轻的婴儿。 在2022年的一次会议上，还报告了来自三个额外进行中的ETVAX研究的额外安全性和现场数据。研究包括前往贝宁的旅行者、赞比亚儿童或成人以及冈比亚儿童，这些研究支持疫苗的持续临床开发。
肌肉内肠毒性大肠杆菌亚单位疫苗与dmLT佐剂展示有希望的安全性和免疫原性概况
在健康成人中进行了肌肉内传递dmLT与CssBA（针对CS6的亚单位ETEC疫苗）的研究，这是一项剂量递增的试验（NCT03404674 ）。该疫苗安全且普遍耐受良好，然而，观察到较高剂量的dmLT（0.5 μg）会引起短暂的肌肉痛和轻度的反应原性（红斑、硬化）。观察到dmLT剂量依赖性增强抗原特异性血清（IgA、抗CS6和-LT IgG）和抗体淋巴细胞上清液（ALS）滴度。这是第一项报告通过肌肉内途径传递的肠毒素佐剂的安全性和免疫原性的研究。
针对脊髓灰质炎疫苗的肌肉注射和dmLT佐剂组合显示良好的安全性但效益不确定
为了解决脊髓灰质炎根除的迫切需求，包括剂量减少和刺激粘膜免疫，dmLT在两项最近的试验中与灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）结合使用，通过肌肉注射和皮内注射在已接种IPV的健康成人中进行了评估。第一项评估了0.5 μg dmLT与单一皮内1/5分数人类剂量的IPV（fIPV）的组合（NCT03922061 ），而第二项评估了单一肌肉注射全剂量IPV与0.5 μg dmLT的组合（NCT04232943）。两项研究中的不良事件（AEs）均为轻度至中度，然而皮内给药与注射部位增加的反应原性相关（硬化、瘙痒和色素沉着）。免疫原性评估结果混合。虽然dmLT增强了通过皮内给药对所有3种脊髓灰质炎病毒血清型（PV1–3）的系统免疫反应，但在肌肉注射研究中未观察到这种效应。其原因尚不清楚，但可能与抗原：佐剂比例的差异或给药途径的差异效应有关。在后续研究中，在第28天双价OPV1,3挑战后未检测到病毒脱落的差异，并且在任何研究中很少检测到针对脊髓灰质炎病毒的粪便抗体反应。正在进行的额外mOPV1挑战研究将评估fIPV皮内接种+ dmLT后的病毒脱落（NCT05327426）。
鼻内流感疫苗和LTh(αK)佐剂是有希望的，尽管缺乏分子细节 虽然对于LT佐剂的鼻内给药存在担忧，因为之前与面部麻痹有关，但一种新型的完全遗传解毒LT，完全抑制了ADP-核糖基转移酶活性，被称为LTh(αK)，被认为是一个安全的替代品。在之前的一项I期研究之后，一个多中心II期随机对照试验评估了三价血凝素（HA）流感疫苗单独或与30或45 μg LTh(αK)佐剂结合使用，在354名成人中于第1天和第8天通过鼻内给药（NCT03784885）。虽然较高佐剂剂量组中轻度和中度预期不良事件有所增加，但并未发生相关的严重不良事件或面部麻痹。LTh(αK)佐剂在两种剂量下都增强了系统IgA和粘膜sIgA反应，直至接种后180天，这支持了对粘膜佐剂用于鼻内疫苗配方的进一步调查，包括但不限于流感。然而，应该注意的是，AB5分子中的实际氨基酸变化在文献中尚未描述。因此，需要进一步验证LTh(αK)的安全性，以确定这个分子如何避免增加面部麻痹的风险。鉴于这种罕见的不良事件可能在疫苗许可后才会被发现，以及有关B亚单位神经结合的机制报告，这一点尤其重要。
临床前疫苗报告显示肠毒素佐剂对多种疾病有益处
在多种动物模型中进行的超过30项独特的临床前疫苗研究已经发布，如表2所总结，结果大多良好。疫苗针对由革兰氏阴性细菌引起的肠道疾病，包括ETEC 、幽门螺杆菌 、霍乱弧菌 、耶尔森氏菌和伤寒沙门氏菌；然而，呼吸道病原体包括非型（NT）流感嗜血杆菌（也评估了中耳炎）、肺炎克雷伯菌 、肺炎链球菌 和铜绿假单胞菌 ；还有一项报告针对尿路致病性大肠杆菌（UPEC）的尿路感染。使用肠毒素佐剂的病毒疫苗也已经发布，包括流感 、人类免疫缺陷病毒（HIV）和脊髓灰质炎。有一项研究评估了寄生虫目标，贾第虫。
大多数研究通过动物模型评估了免疫原性或对疾病或微生物定植的保护
值得注意的是，在非人灵长类动物（NHP）模型中观察到了保护，包括在Aotus nancymaae中通过dmLT皮内注射CF抗原疫苗预防ETEC腹泻疾病，作为临床试验的支持。在另一项研究中，恒河猴在异源蛋白抗原增强（皮下（s.c.）或注射颊部）和dmLT后的重复挑战模型中显著受到保护。
主要评估了突变的AB5或A亚单位佐剂分子
这些研究中的大多数使用了表2所示的混合dmLT，但也使用了CT和CT的多重突变版本（mmCT）。在三种情况下，将dmLT与其他疫苗佐剂（氢氧化铝、CpG、MPLA和SLA-SE）进行了比较，并发现它们等效或更优。作为另一种策略，为了最小化鼻疫苗中AB5肠毒素（例如，贝尔氏麻痹，参见参考文献[1]）的不良事件，探索了A亚单位佐剂。这包括LTA1结构域（LTA1）或CTA1与特定于B细胞的细胞靶向基序（金黄色葡萄球菌蛋白A(DD)的CTA1 D结构域）结合，如图1所示。值得注意的是，使用小鼠的组织学和嗅觉行为变化作为贝尔氏麻痹的替代分析，报告了与CT或LT相比，通过鼻内LTA1的安全性有所提高。在鼻内（或咽部）K. pneumoniae疫苗接种后，dmLT和LTA1佐剂的等效性也有所报告。
多种途径和配方选项
测试了多种途径（例如，肌肉注射、粘膜或皮肤），并将肠毒素佐剂与细菌或寄生虫亚单位（蛋白质、多糖和结合物）、灭活病毒或病毒载体抗原结合。一项研究成功探索了一种遗传方法，使用DNA疫苗。观察到蛋白质和多糖或特定于半抗原的免疫。增强了对药物滥用药物芬太尼的保护，通过dmLT或LTA1疫苗接种和半抗原结合物抗原。在小鼠中，与其他途径/佐剂相比，通过dmLT或LTA1初次/增强接种使用系统初次和粘膜增强（分别是肌肉注射/舌下和肌肉注射/鼻内）对芬太尼的保护优于仅肌肉注射氢氧化铝疫苗，并且与IgA和IgG2a亚型最相关。然而，随后在大鼠中进行的研究也发现，在肌肉注射dmLT疫苗后也有保护。
一些研究探索了不同的佐剂配方，包括稳定缓冲液，用于计划大规模灌装和分发dmLT，以及创新的建模方法。
在小鼠疫苗研究中发现，即使在特定缓冲液中在37°C下储存1周后生化分析显示聚集或AB5结构变化，dmLT生物活性仍然完好（通过皮内和舌下传递），甚至在pH3变性条件下（皮内但不包括舌下传递）。三项研究探索了新的传递机制，包括微针、粘膜粘附贴片或舌下注射，使用dmLT或CT增强疫苗或疫苗前配方研究中抗原传递到舌粘膜或颊粘膜组织。
新发现的免疫机制 临床研究揭示剂量重要性及潜在生物标志物
最近一系列报道的临床、动物和体外研究在先前对肠毒素佐剂如何工作的理解基础上进行了扩展。首先，来自最近人类研究的重要见解包括观察到的给药途径的差异、肠毒素佐剂增强系统性和粘膜免疫反应的能力，以及它们使抗原剂量减少跨年龄组的能力。值得注意的是，这些反应随着佐剂剂量的增加而趋于平稳，表明存在最佳的抗原：佐剂比例，以限制毒性同时优化保护。已经提出了一种用于口服疫苗诱导的IgA免疫的生物标志物，使用血液中B细胞成熟抗原基因（TNFSF17）的转录表达，发现与ETVAX疫苗中包含dmLT相关。
多种因素影响保护性免疫的产生
给药途径可以显著影响使用肠毒素佐剂的疫苗接种结果( 和表2)。例如，LTA1或dmLT佐剂疫苗在某些情况下，通过粘膜给药比通过父母给药更优越，但并非所有疫苗配方都如此。这些差异可能追溯到抗体亚型的产生或粘膜浆细胞的归巢。使用遗传小鼠模型或靶向耗竭，探索了对实验性挑战的保护性免疫的其他要求。这包括CD4 T细胞、CD4 T辅助(h)17细胞、IL-17A或IL-17R成纤维细胞信号传导。B细胞和IgA被发现不是必需的、部分必需的（例如细菌传播）或必需的（例如被动抗体转移提供了保护）。这些情境性发现可能受到疾病和疫苗参数的影响。因此，不能将一种类型的免疫归因于肠毒素佐剂，尽管CD4 T细胞和B细胞通常是关键参与者。
粘膜肠毒素疫苗接种的特殊粘膜结构和微生物群要求也有报道
在一项研究中，口服dmLT免疫在环境肠道功能障碍环境中无效（一种模拟营养不良和肠道感染的小鼠模型，类似于贫困儿童的情况），原因是诱导了特殊的肠道调节性T细胞[51]。微生物群的短链脂肪酸代谢产物也被发现对CT的佐剂活性至关重要（通过口服），但实际上黏液纤毛运动的丧失增强了疫苗效果（通过鼻内）。然而，另一项研究在dmLT疫苗通过皮肤（t.c.i.）或肌肉注射(s.c.)给药后，没有观察到肠道微生物组的变化。
肠毒素结构和佐剂组合的贡献
肠毒素结构，包括AB5（和GM1结合）与A亚单位蛋白，也可以指导APC刺激的幅度，尽管与先前的文献相反，这些变化似乎不依赖于蛋白激酶A信号。体内APC激活已经通过B细胞靶向CTA-DD佐剂进行了精心研究，并发现增加了T滤泡辅助细胞和B细胞生发中心活动。两项研究还探讨了使用遗传小鼠模型，哪种特定的T细胞亚群诱导IgA免疫。结果为证明，抗原非依赖性Tfh细胞而不是疫苗诱导的Th17或β7+（肠道归巢）T细胞在口服疫苗后推动IgA提供了支持证据。
最后，一些有趣的研究已经开始探索新的佐剂组合（例如dmLT + TLR4激动剂，编码LTA1的DNA和免疫信号分子IL-12、IL-33、sCD80等）。未来的研究应该解决如何将抗原和佐剂(s)的独特组合最好地提供长期保护性免疫。
结论和肠毒素佐剂的未来方向
我们认为，这些研究表明了在开发克服旧分子缺陷的肠毒素佐剂方面取得了令人兴奋的进展。具体来说，由突变dmLT领导的这新一代肠毒素佐剂，允许以独特和安全的方式产生增强的保护性免疫，特别是对粘膜病原体。主要的临床进展包括增加对口服ETEC挑战的保护（ACE527 + dmLT）以及在婴儿和儿童中扩大的安全性和免疫原性概况（口服ETVAX + dmLT）或在成人中的注射配方（CssBA ETEC、脊髓灰质炎 + dmLT疫苗）。新的鼻内佐剂形式也是有希望的，可能会克服以前与面部瘫痪相关的安全问题，然而，LTh(αK)的报告缺乏关键细节，需要更多的研究。只有A亚单位的佐剂（LTA1、CTA1-DD）在临床前研究中迅速显示出成功。未来对这些新型佐剂用于鼻内给药的研究可能会转化为额外的临床成功。重要的是，稳定性评估表明，像dmLT这样的配方不需要持续冷藏，这一发现可能会极大地有利于这些有前途的新疫苗的广泛开发和部署。
临床前研究也支持将肠毒素佐剂与针对细菌、病毒、寄生虫和药物滥用药物的疫苗结合使用的好处。这包括与无佐剂对照的重要比较。额外的挑战模型为疫苗保护效力提供了重要的验证，以抵御啮齿动物和灵长类动物的疾病。此外，通过系统性和粘膜途径传递肠毒素佐剂的能力，结合其与许多抗原类型（灭活、蛋白质、多糖、半抗原、DNA等）的简单混合能力，为疫苗设计提供了巨大的灵活性。我们认为这些是为什么这类佐剂是疫苗设计的重要资源的关键因素。使用遗传模型、耗竭研究和其他复杂的技术已经揭示了成功疫苗接种依赖于给药途径和产生独特的CD4 T细胞和B细胞反应。然而，并没有观察到跨疾病目标的特定组合的佐剂、途径或保护机制（Th1、Th17、IgG和IgA）。这表明，实证临床前研究对于每种疫苗和疾病目标仍然至关重要。因此，尽管肠毒素佐剂是强大的疫苗组成部分，但是佐剂与给药途径、疫苗抗原和疾病目标之间的整体相互作用塑造了适应性免疫反应，并推动了保护性免疫。
总之，最近的临床研究为肠毒素佐剂提供了激动人心的安全性和有效性数据，特别是对于dmLT。继续推进利用这些佐剂以增强广泛疾病疫苗接种结果的策略，在临床前报告和机制研究中显而易见。
