摘要: 在过去的十年中，发现和开发疫苗的新方法已经彻底改变了这一领域。在COVID-19大流行期间，利用信使RNA和病毒载体等新平台，取得了进展，使得每年可以生产数十亿剂疫苗。分析工具箱、设备和生物工艺技术的改进使得疫苗开发的速度和疫苗制造的规模都达到了前所未有的水平。大分子结构-功能表征技术，结合改进的建模和数据分析，使得在单粒子分辨率下对疫苗配方进行定量评估，并指导疫苗药物物质和药物产品的设计成为可能。这些进展在精确评估由新平台交付的疫苗的关键质量属性方面发挥了重要作用。无标记和免疫分析技术的创新有助于抗原位点的表征和稳健的体外效力测定方法的开发。这些方法，以及分子技术如下一代测序，将加速所有平台交付的疫苗的特性描述和释放。用于实时监测和优化工艺步骤的过程分析技术使得实施质量由设计原则和加快疫苗产品的释放成为可能。在下一个十年中，疫苗发现和开发领域将继续进步，汇聚新技术、方法和平台，以改善人类健康。
1.引言
2012年，《疫苗工艺技术》综述发表在《生物技术与生物工程》杂志上，聚焦于用于生产预防人类各种传染病疫苗的多种技术。在过去的十年中，该领域取得了巨大的进步，部分原因是由于投入到开发安全有效的COVID-19疫苗的资源大幅增加。这种密集努力的一个意外结果是，新的疫苗平台被引入并优先考虑，特别是信使RNA（mRNA）和复制缺陷腺病毒，而不是更传统的方法，如使用蛋白质抗原作为疫苗。在过去的10年中，DNA和RNA含量疫苗取得了巨大进步，这些疫苗本身不包含感兴趣的抗原，而是携带指令，让接受者的细胞自己产生抗原。病毒载体和mRNA脂质纳米颗粒（LNP）疫苗就属于这一类。自2012年以来，已有十种新的病毒载体疫苗和两种mRNA-LNP疫苗获得批准（表1）。自2012年综述以来，还批准了许多其他重要的疫苗。Flucelvax®，第一种使用细胞培养技术生产的流感季节性疫苗，于2012年在美国推出（诺华，现为Seqiris）。Flucelvax工艺使用悬浮MDCK细胞培养作为病毒扩增的基质，而不是鸡蛋。该疫苗最初于2007年在欧洲以OptaFlu的名义获得批准。一年后，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Flublok®，这是一种使用杆状病毒表达系统生产的昆虫细胞培养重组流感疫苗（Protein Sciences Corporation，2017年被赛诺菲收购）。该疫苗于2016年从三价变为四价，并在2020年获得了欧洲药品管理局（EMA）的批准。Flublok®利用重组表达的血凝素（HA）蛋白，精确匹配选定的毒株，避免了病毒适应鸡蛋或细胞培养可能导致的抗原漂移问题。
2017年，FDA批准了GSK的带状疱疹（HZ，水痘）疫苗Shingrix，用于50岁及以上的成年人。该疫苗是一种在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的重组糖蛋白抗原，并进行冻干，另外还有一瓶AS01B佐剂液体悬浮液用于重悬。疫苗悬浮液含有50微克的重组水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白E，通过两种佐剂增强免疫原性：基于脂质体的AS01B佐剂系统含有50微克的3-O-去酰基-4'-单磷脂A（MPL）和50微克的皂角刺Molina，分数21（Shingrix [包装插入]，2023）。同样在2017年，Dynavax的乙型肝炎疫苗Heplisav-B获得了FDA的批准，该疫苗含有新型胞嘧啶磷鸟嘌呤（CpG）1018®佐剂和重组蛋白亚单位抗原。该产品于2019年在欧洲获得批准。CpG 1018®佐剂是一种修饰的骨架寡核苷酸，模仿细菌和病毒DNA以刺激先天免疫系统。2019年，FDA批准了JYNNEOS®（Bavarian Nordic A/S），这是一种天花和猴痘疫苗，适用于18岁及以上被认为有高感染风险的成年人。JYNNEOS®是一种由MVA-BN株生产的活疫苗，是一种减毒的、非复制的正痘病毒。MVA-BN在悬浮于无直接动物来源材料的无血清介质中的初级CEF细胞中生长，然后收获、纯化并经过几个切向流过滤（TFF）步骤浓缩，包括苯佐酶消化。为了增加疫苗供应，在2022年8月，FDA发布了JYNNEOS®的紧急使用授权（EUA），用于皮下（s.c.）给药（0.5毫升）给18岁以下个体，以及用于皮内（i.d.）给药（0.1毫升）给18岁及以上个体。2020年，世界卫生组织（WHO）发布了nOPV2的紧急使用清单（EUL），作为全球脊髓灰质炎根除战略的一部分（World Health Organization, 2020b）。该疫苗使用改良的Sabin株（nOPV2株S2/cre5/S15domV/rec1/hifi3）的活减毒脊髓灰质炎病毒2型，在非洲绿猴肾细胞中制备。为了减少疫苗衍生脊髓灰质炎的发病率，该疫苗在亲本基因组中进行了五项修改，影响了V域、cre元素和RNA依赖性RNA聚合酶，从而提高了遗传稳定性并降低了重组率。同样在2020年，WHO预认证了第一种Sabin灭活脊髓灰质炎疫苗（sIPV，注射用，LG Chem）。该疫苗使用微载体上的Vero细胞生产，生产过程中不使用野生型病毒，降低了回复突变的风险。此外，细胞生长介质从含血清的介质改为无动物组分（ACF）介质，在病毒灭活前增加了一次透析步骤，并使用了重组胰蛋白酶。最近，2022年9月13日，美国加入了满足WHO标准的30个国家名单，这些国家流通疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（cVDPV）。在2020年初COVID-19大流行开始后不久，200多种全球疫苗候选者中的第一种进入了临床试验（McGill University Interdisciplinary Initiative in Infection and Immunity [MI4], 2022）。到那一年的12月，监管机构开始授予首批EUAs。到2023年3月，已经接种了超过130亿剂COVID-19疫苗。据估计，仅在2021年，就有超过1400万人因新疫苗而获救。加速疫苗开发的因素包括对新方式（mRNA和复制缺陷腺病毒）的预先投资以及政府对临床研究的巨额资助。大约40%的剂量是以前建立的全病毒灭活型，其余的剂量在两种类型之间平均分配：mRNA-LNPs和腺病毒载体（表2）。从化学、制造和控制（CMC）的角度来看，为了缩短从证明有效性到广泛提供疫苗剂量的时间线，疫苗制造和分析也取得了显著进步，支持生产规模从每年数百万剂增加到数十亿剂。制造规模和效率的变化需要复杂的分析表征能力。
在这篇综述中，我们描述了在过去10年中取得的技术进步，这些进步使得开发和制造用于预防人类各种传染病的新疫苗成为可能。这些进步，特别是在mRNA和病毒载体递送方面，也适用于治疗性癌症疫苗的新兴领域。本综述的范围涵盖了整个疫苗制造过程，从细胞培养和无细胞系统到配方、纯化、稳定性、分析和监管环境的变化。
2.细胞培养
细胞培养已被越来越多地用于表达疫苗制造中的抗原（图1）。病毒表达可以在贴壁细胞系或悬浮适应细胞系中实现。
2.1.贴壁细胞系
历史上，由于对安全问题的担忧，疫苗制造中使用的细胞系选择受到限制。随着时间的推移，可用的选择越来越多，特别是连续细胞系的使用；这一进展最近已经总结。一个基于贴壁细胞系的疫苗例子是重组水泡性口炎病毒（rVSV）基埃博拉疫苗，rVSVΔG-ZEBOV-GP（商品名ERVEBO®），最初作为反生物恐怖主义制剂构建和特征描述。rVSV Indiana株包含一个缺失的VSV包膜糖蛋白，被扎伊尔埃博拉病毒（ZEBOV）Kikwit 1995株表面糖蛋白替换，它在Vero细胞中生产。最近的创新还包括开发了各种一次性生物反应器（SUBs），其单位体积的表面积非常大；例如，Dohogne和同事描述的生物反应器。Drugmand等人在2020年描述的固定床反应器结合了强化的连续和自动化的一次性使用生物处理方法。描述的脊髓灰质炎疫苗的例子将上游处理、下游处理和灭活联系在一起。
2.2.悬浮培养
几种疫苗细胞培养应用涉及悬浮培养。在生产蛋白质方面，昆虫细胞培养（Sf9）与杆状病毒表达已成功使用；例如，大规模生产FDA批准的流感疫苗的HA蛋白。或者，病毒生产的宿主细胞，如Vero细胞或PER.C6细胞，可以适应悬浮培养。如果细胞培养可以适应，细胞通常可以在传统的搅拌罐生物反应器中使用成熟的方法培养。许多为CHO细胞培养开发的技术改进已用于制造抗体，可以应用于疫苗制造。最近，工业界从10,000-20,000升规模的不锈钢生物反应器转向大约3000升规模的SUBs。Watterson等人描述了一种使用CHO细胞表达的SARS-CoV-2 Sclamp疫苗候选物，它适用于大规模商业制造，并在2-8°C下稳定。当与MF59佐剂配方时，它激发中和抗体和T细胞反应，并在动物挑战模型中提供保护。在CHO细胞中表达的VZV的截短糖蛋白E是效果非常好的Shingrix疫苗的基础。用于疫苗的细胞培养技术可能与用于大规模制造抗体的技术非常相似。牛津大学的研究人员在COVID-19大流行期间领导了有效疫苗的开发工作，使用的平台基于复制缺陷腺病毒用于传递刺突蛋白。该平台的放大在2022年ECI会议上描述。该平台涉及使用悬浮细胞培养表达复制缺陷腺病毒以传递冠状病毒刺突蛋白，是可扩展的，并已成功转移到多个制造场所，由阿斯利康公司在大约18个月内供应超过10亿剂COVID-19疫苗。
3.微生物生产
微生物发酵平台传统上被用来制造主要类别的疫苗，它们仍然至关重要。人乳头瘤病毒（HPV）表面的L1蛋白由酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达，并组装成病毒样颗粒（VLPs）以创建Gardasil疫苗。乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原由S. cerevisiae或Pichia pastoris表达。基于DNA质粒的疫苗候选物通常由大肠杆菌（Escherichia coli）细菌发酵制造（Liu, 2019）。肺炎球菌结合疫苗由特定肺炎链球菌菌株表达的荚膜表面多糖（CSPs）与白喉CRM197蛋白结合而成。一些重要的疫苗最初作为活减毒病毒（LAV）疫苗，如HZ疫苗，最终被单一重组VZV糖蛋白与佐剂系统取代。过去十年中，开发了能够高产量生产的替代培养，如基于真菌培养的Dyadic平台Thermothelomyces heterothallica（称为C1）。C1基于的系统可以在几周内开发出表达免疫活性抗原的稳定菌株；通常，产量比其他成熟系统高。C1基于的系统易于扩展到工业规模，并且具有成本效益，使用标准微生物发酵反应器和廉价培养基。一种使用C1表达技术制造关键受体结合域（RBD）组分的COVID-19疫苗候选物目前正在临床评估。麻省理工学院的研究人员开发了一种基于P. pastoris的平台，该平台完全自动化，可以用来制造包括疫苗抗原在内的大量蛋白质。选择这种酵母是因为它能够快速生长到高细胞密度，并接受蛋白质表达。使用类似技术生产三价疫苗候选物的轮状病毒正在进行中，使用高度自动化的生物反应器框架，包括端到端能力。
对于蛋白质抗原来说，技术挑战通常是要能够可靠地生产出暴露关键表位的抗原，以便它们能被免疫系统识别。这一点在基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗中尤为明显，比如HPV疫苗，其中复杂的分析能力对成功至关重要。对于mRNA疫苗而言，大肠杆菌发酵仍然是生产用于体外转录（IVT）成mRNA的质粒DNA（pDNA）模板的主要方法，比如辉瑞-BioNTech的Comirnaty®和Moderna的Spikevax® mRNA疫苗。无细胞合成pDNA正在取得进展（见无细胞合成部分），但由于酶和核苷酸/核苷的成本高昂，其成本效率仍然不如微生物生产。pDNA作为IVT反应的原料，所需的总量明显少于DNA疫苗，因为可以从单个线性化的pDNA模板制造出许多mRNA副本。用于IVT的pDNA序列通常需要大量的重复元素（例如，聚（A）尾），这影响了大肠杆菌菌株的选择。许多行业主力菌株最初是为了高产pDNA而优化的，而不是pDNA的保真度，但现在有多种菌株能够正确复制带有重复元素的大型质粒。最近描述了一种在大肠杆菌中制造结合疫苗的新方法，通过将关键酶插入细菌。这种方法绕过了先分别制造蛋白质和多糖，然后纯化、化学结合和重复纯化的要求。
自不锈钢压力容器制造规模达到500-5000升以来，发酵设备已经取得了许多创新，这些容器越来越复杂，难以自动化、清洁、验证和操作。由于建设成本高昂，发达国家只有有限数量的大型制造场所。在过去十年中，微生物和细胞培养的一个重大进步是转向了一次性使用系统（SUBs）。在一次性SUBs上进行了大量投资，允许通过消除清洁和消毒以及增加灵活性，在较小规模上制造微生物培养物。许多微生物培养的常见条件，如压力、高气流速率、溶剂和稳健的温度控制，限制了SUBs在疫苗制造中的最大规模达到约3000升。对于纯化，已经建立了完整的一次性选项工作流程——从深度过滤、切向流过滤用于浓缩和透析，以及用于色谱的一次性可抛弃柱（在纯化部分讨论）。疫苗制造商正在努力建立一次性系统的第二供应商，以避免供应链问题。行业倡议，如NIIMBL，正在建立具有标准化、供应商不可知的组件和连接的灵活一次性系统。最终用户和技术提供商也在合作，为一次性组件提供可持续的回收和循环经济策略。
4.无细胞合成
IVT疫苗，包括蛋白质和RNA疫苗以及VLPs，已经成为加速疫苗工艺开发和制造的优雅而简单的方法。无细胞IVT从用于在T7 RNA聚合酶酶控制下转录复制子RNA的线性DNA模板开始（图2）。IVT反应在几小时内完成，产生如RNA这样的产品，浓度为3-5 mg/mL。对于RNA疫苗，可以通过在IVT反应中补充m7GppG帽结构类似物，并保持帽分子与RNA序列的第一个核苷酸（GTP）的摩尔比高，来对RNA复制子的5'端进行封顶（图3）。封顶已经作为共转录封顶商业化，使用CleanCap试剂。或者，可以使用封顶酶（VCC）和甲基供体作为底物，在第二个酶促反应中对mRNA进行封顶。与帽类似物的60%-80%相比，VCC封顶效率更高（100%），但共转录封顶是一个更快的过程，因为它不需要第二个酶促反应步骤。在IVT结束时，添加DNAase I酶来降解DNA模板，然后添加EDTA来抑制DNAase活性，稳定RNA产品，并减少RNA沉淀。去除包括酶、残留NTPs、DNA模板和异常mRNAs（双链[ds]RNA和截断的RNA片段）在内的杂质至关重要，因为RNA纯度已被证明会影响翻译效率，并改变疫苗在体内的免疫刺激反应。例如，通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）去除双链RNA（dsRNA）后，蛋白质表达增加了10-1000倍。TFF已用于IVT后RNA的广泛纯化，纯度达到90%-99%，产量为90%-95%。TFF也通过色谱法辅助去除dsRNA，如纯化部分所讨论的。对于RNA，可以通过一次性兼容的RNAase-free系统（如图2所示）实现规模化，如微孔板、管子和包括摇摆运动或搅拌罐的生物反应器。
图2 无细胞体外转录（IVT）反应用于RNA生产。典型的反应起始于2-5毫升用于优化筛选（2-10毫克），10-15毫升IVT用于动物研究（25-50毫克），5-20升用于临床研究（10-50克），以及高达50-200升用于商业制造（125-500克）。IVT，体外转录。
图3 通过体外转录（IVT）形成的mRNA结构。图片改编自Linares-Fernández等人。mRNA，信使RNA。
简化的RNA制造过程使疫苗开发速度加快；例如，从DNA模板到首次人体试验仅用了42天就完成了SARS-CoV-2疫苗的开发。IVT RNA疫苗候选物的商业化时间也可以减少到不到2年。商业设施可以小2-3个数量级，建造时间减半，前期资本成本降低到原来的二十分之一。在一个低成本的2000万美元的设施中可以生产10亿剂。通过使用封闭处理，可以进一步降低设施成本，这允许在较低级别的洁净室设施中生产。虽然取消更高级别洁净室的要求节省了能源和资本成本，但试剂成本主导了IVT过程的经济学，占生产成本的高达96%（COGs；表3）。对于GMP的物料和试剂供应是一个限制因素，特别是确保酶试剂是无细胞滤过（ACF）和GMP级别的复杂性增加。最小化试剂使用的方法非常重要；方法包括IVT后封顶和集成连续处理，其中反应速率可以加快，试剂可以重复使用。也在开发自动化RNA生产系统，其中IVT反应与纯化步骤在单个封闭系统下通过机器人操作集成。同样，微流体系统已经将RNA集成到LNP生产中，用于个性化疫苗方法（图4）。如今，可以使用台式系统来简化发现构建工作流程，因为寡核苷酸被组装成全长DNA或mRNA序列，规模为10微克，无需pDNA模板。未来，可能会出现台式核苷酸制造系统。
图4 脂质纳米颗粒组装工作流程。图片改编自Guevara等人。
虽然单链RNA的设计结构已经非常成熟，但新的RNA治疗方式仍在不断扩展。自扩增mRNA（sa-mRNA）具有高拷贝数和随后的高抗原表达，其有效剂量比单链RNA低60倍。跨扩增mRNA（taRNA）也在动物研究中得到了建立，其中一个mRNA模板编码复制酶，而单独的模板扩增多个目标mRNA，同时编码不同的蛋白质。共价闭合环状RNA（circRNA）在动物模型中显示出连续翻译蛋白质的可行性。circRNA由IVT线性RNA生成，可以通过多种方法如T4 RNA连接酶或内含子剪接进行环化。这种稳定的闭合环状结构提供了免受外切核酸酶切割的保护，不需要5′端封顶或3′聚（A）尾，并且有可能在室温下保持稳定（Bai et al., 2022）。预计通过机械建模和人工智能（AI）工具引导的计算机辅助分子设计将继续改进分子设计，优化半衰期、稳定性和效力（Mukhopadhyay & Hart, 2021），同时也改善CMC属性，包括杂质减少。最近的工作显示，通过降低IVT中Mg2+水平、在50°C下进行更快的反应以及应用高盐转录策略，进一步提高了产量和纯度，减少了dsRNA。这些扩展工艺设计空间的努力可以通过扩展自动化筛选工具来支持，以实现IVT、纯化和过程分析的集成工作流程的统计设计实验。
除了RNA之外，无细胞制造已经为各种疫苗类型展示了其可能性，包括亚单位、结合疫苗、VLPs和膜增强疫苗。这些例子主要使用大肠杆菌的裂解系统，尽管使用了包括CHO、小麦胚芽和烟草在内的一系列来源。商业上可用的试剂盒提供了快速创建材料的方法，用于发现和工艺开发，并已证明可以扩大规模以支持临床制造。最近的一项研究应用无细胞表达技术成功生产了下一代24价肺炎球菌结合疫苗，与当前的护理标准相当。无细胞平台表达了一个增强的载体CRM蛋白序列，该序列包含多个非天然氨基酸。它们位于主要T细胞表位的外部，可以进行位点特异性共价结合，有潜力改善血清型覆盖。无细胞疫苗生产的更广泛采用仍然受到限制，因为翻译后修饰的挑战、对细菌源系统的免疫原性担忧、二硫键折叠复杂性以及扩大规模的试剂成本。预计在未来10年内，随着基于哺乳动物的裂解系统和连续处理系统的应用进步，这些将得到改善。
5.纯化
在过去的十年中，疫苗的纯化继续从复杂的工作流程转向更加标准化和强化的方法。图5中总结了一些例子。这种关注继续推动降低成本和剂量，同时提高吞吐量和产量。在细胞收获、深度过滤、细胞裂解和过滤方面取得了逐步改进，如最近综述所总结。膜设计的改进促进了从离心到深度过滤的转变，或两者的结合。可用的更高MWCO膜的扩展支持了更大病毒的浓缩、缓冲液交换和杂质减少（宿主细胞蛋白[HCPs]）。单次通过TFF的持续改进使得强化和连续工作流程成为可能。病毒产品的无菌过滤随着膜设计的改进而继续提高。
图5 疫苗生产工艺流程。对比传统工艺流程与强化/集成的未来方法。
亲和捕获色谱选项的扩大为简化和标准化工作流程提供了关键优势。对于病毒处理，亲和捕获的可用性在减少单元操作数量方面提供了显著优势，如图5所示。从头开始的工程配体设计的进步导致了针对病毒疫苗的高特异性和可调亲和力配体，以及在温和洗脱条件下的强大杂质清除。商业上可用的来源，如那些来自骆驼单链域的，已经为一系列腺相关病毒（AAV）血清型如Capture select AAV9建立了基础。配体设计的改进继续增长，如短基（5-15个氨基酸）配体，使用组合化学方法和分子印迹的计算机辅助设计的聚合物，用于快速配体粒子生成。对于RNA，脱氧胸腺嘧啶（oligo dT）配体已成为亲和捕获方法，该方法结合到3′聚（A）尾。包括dsRNA在内的杂质可以通过结合OligodT和抛光IEX高效去除。亲和色谱的进步使得多柱处理效率改进的更广泛采用成为可能。例如，对于腺病毒，两柱逆流色谱法与尺寸排除色谱（SEC）的六倍生产力增加，实现了86%的回收率和90%和89%的DNA和HCP清除率。Fischer等人对流感A病毒的纯化采用了类似的强化方法。四元胺（QA）阴离子交换单体与模拟移动床色谱实现了89%的病毒产量和>98%的DNA清除。
从传统的树脂珠基分离到膜和单体的对流格式的转变（图6）继续获得更广泛的采用。树脂珠的扩散限制，其中大病毒颗粒难以接触到珠内的配体，通过具有更大孔径和更高流速的对流传输膜的优势得到克服，包括微孔水凝胶纳米纤维和单体格式。这些已成功应用于一系列疫苗产品，典型的回收率为60%-90%，最小限度的杂质结合，包括99%的HCP和残留DNA（resDNA）去除和5-log内毒素降低。去除的杂质包括病毒、VLPs、噬菌体、细胞外囊泡、pDNA和RNA。单体处理的效率最近通过IEX单体纯化风疹病毒悬浮液在1小时内完成，与树脂珠相比超过10小时得到了证明。
对增强工艺和提高上游表达滴度的追求重新激发了人们对非色谱方法的兴趣，如沉淀、水相两相提取（ATPE）和结晶。无色谱工艺有潜力将成本降低20%-30%，并且更适合连续处理。利用实验设计统计学可以减轻优化条件的复杂负担，以最大化目标稳定性和完整性，涉及pH值、温度、电导率和混合物组成。典型的聚乙二醇（PEG）沉淀例子包括使用5% PEG和0.5 M NaCl实现85%的甲型肝炎病毒回收，同时减少65%的宿主细胞蛋白（HCP）。然后将裂解液用核酸酶处理，以防止核酸/病毒聚集体的共沉淀。mRNA沉淀已与切向流过滤（TFF）结合使用，以捕获沉淀物，并通过透析去除杂质，然后重新溶解。预计可以通过使用塞流或盘绕流反转反应器实现连续疫苗沉淀。随着上游滴度的提高，ATPE的强化涉及混合两种聚合物和kosmotropic盐（磷酸盐-柠檬酸盐、硫酸盐）的溶液，可以克服历史上体积过大且过于稀释的提取系统。最近的例子表明，使用PEG/盐组合在提取的上相中分离包括病毒、病毒样颗粒（VLP）和细胞外囊泡在内的一系列疫苗产品是可行的，从粗裂解液中实现了70%-99%的回收率，Turpeinen等人展示了使用45% PEG和30%柠檬酸混合物在连续模式下，通过简单的螺旋混合器实现了99%的HIV VLP回收和73%的DNA去除，这种方法应该减少大体积缓冲液的使用和处理时间。尽管疫苗结晶作为纯化工具仍处于起步阶段，但一些最新进展显示出引人注目的机会。例如，已经展示了非复制性轮状病毒疫苗候选物（VP8亚单位蛋白与破伤风毒素P2表位融合）的结晶。在悬挂滴蒸发扩散系统中评估了结晶条件，然后使用蒸发技术进行放大。随后发现抗体结合谱与结晶前相似。技术还扩展到可调结晶大小控制与连续 Slug 流结晶。这些技术为疫苗结晶在连续生产中的使用打开了可能性。将很有趣地看到技术发展能将杂质从目标分子中清除多远，或者结晶是否需要与色谱或沉淀或两相提取结合使用。在未来10年，预计工艺将进一步强化和集成到更小的占地面积，从而提供更低成本的工艺，以便于全球部署。改进的技术可能导致单步色谱和连续处理，以及单次切向流过滤和昂贵试剂回收的可持续实践，这对于RNA生产尤为重要。支持非色谱工艺的技术，包括结晶，预计将进入临床前开发。所有这些活动都将得到机理建模的支持，用于AI引导的工艺开发和支持自主运营的先进控制策略。
6.药物产品（DP）处理
大多数获批的疫苗通过肌肉内（IM）、皮下（s.c.）或皮内（i.d.）注射给药，还有一些口服和鼻疫苗获批。此外，正在进行的开发计划包括通过吸入将疫苗输送到肺部，以及使用微针贴片输送到皮内空间。无菌注射DP制造包括混合（配方）、灭菌过滤（大多数情况下）、填充小瓶或预填充注射器、视觉检查、贴标签和包装（即填充-完成）。一些疫苗在填充后需要冷冻干燥（冻干）。结合疫苗需要将抗原与载体蛋白结合。最后，可能需要工艺步骤以纳入一些疫苗的佐剂。许多注射用疫苗，如含有减毒活病毒或明胶佐剂的疫苗，不适合无菌过滤，因此上游步骤在无菌条件下进行，以确保无菌。针对COVID-19开发的许多疫苗包括DP制造的创新。其中关键之一是辉瑞-BioNTech的Comirnaty®和Moderna的Spikevax®使用mRNA-LNPs。需要一个全球性的填充-完成站点网络，以建立新的LNP形成和TFF单元操作能力。LNP形成涉及将含mRNA的水溶液和四种脂质的乙醇溶液控制泵入微混合装置，如图4所示。新形成的含mRNA的LNPs物理稳定性非常有限，因此LNP形成步骤紧接着使用TFF进行溶剂和缓冲液交换，以去除乙醇并调节pH值。尽管COVID-19 mRNA-LNP疫苗显示出显著的效力，但一个主要限制是需要冷冻储存和运输，这增加了成本和复杂性，并阻碍了更广泛的分发。辉瑞-BioNTech疫苗目前的保质期为18个月，但必须在-90°C至-60°C之间保持，而Moderna疫苗的保质期为9个月，在-50°C至-15°C之间。最近的一项综述总结了改善mRNA-LNP疫苗稳定性的重点领域，包括优化构成纳米颗粒的脂质、缩短mRNA链长度、增加GC含量，以及使用干燥技术如冻干等。mRNA-LNP疫苗的冻干是可行的，可以提高热稳定性。虽然未来的mRNA-LNP产品可能会被冻干，但目前的mRNA-LNP COVID-19疫苗没有，因为全球冻干能力有限，而且在大流行期间没有足够的能力生产数十亿剂。喷雾冷冻干燥和无菌喷雾干燥等新兴技术未来可能是可行的选择。在某些条件下，单一喷雾冷冻干燥机或喷雾干燥机可以与许多冻干机的吞吐量相匹配（见第6.4节）。对COVID-19的响应还包括重组病毒载体疫苗的重大进展，如阿斯利康的Vaxzevria®（由印度血清研究所生产为Covishield®）、Sinopharm的Covilo®、Janssen的Ad26.COV 2-S、Gamaleya的Sputnik V和CanSino的Convidecia。在过去的10年中，有四种病毒载体疫苗获批用于埃博拉，一种用于登革热（表1）。病毒载体疫苗使用传统的填充-完成技术，包括冷藏液体、冷冻至-20°C和冻干。正在开发许多新型疫苗DP配方和给药方法。有些将需要新的GMP制造步骤，如微针和许多类型的纳米颗粒。
6.1.重组人血白蛋白
在制造或配方中使用任何动物源成分都需要广泛预防污染病原体。白蛋白和明胶长期以来被用作配方成分，以稳定某些疫苗。多年来，白蛋白的来源是汇集的人类志愿者供体血浆。2006年，默克公司获得了在MMR®II上游制造中使用在酿酒酵母中表达的Recombumin®重组人血白蛋白的批准。2019年，默克公司获得了EMA（欧洲委员会，2020年）和FDA（美国食品药品监督管理局，2019年）对使用重组人血白蛋白作为DP配方辅料的ERBEVO® Zaire埃博拉病毒疫苗的批准（默克公司，2022年）。白蛋白是稻米来源的Exbumin®，由InVitria生产（细胞培养盘，2021年）。该疫苗需要在-80°C至-60°C下储存和运输，最多可在2-8°C下存放14天（默克公司，2022年）。预计未来将有更多的疫苗使用重组白蛋白。
6.2.佐剂
佐剂对包括它们在内的疫苗的有效性至关重要，并且它们是开发和制造的专业领域。今天使用的许多佐剂被视为知识产权（IP）。例子包括默克铝佐剂（默克公司）、GSK佐剂系统、MF59®（诺华）、Matrix-M（诺瓦瓦克斯）以及西雅图高级健康研究所拥有的几个佐剂。目前在FDA和EMA批准的疫苗中最常用的佐剂类型是不可溶性铝盐悬浮液（无定形氢氧化铝磷酸硫酸盐、氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾）。这一类已经使用了近100年。它们的基粒子大小在数十纳米，形成松散连接的网络，根据测量方法和剪切条件，测量值为1-20微米。含有铝佐剂的疫苗不会冷冻，因为这会导致佐剂粒子尺寸增加；然而，有足够稳定剂如蔗糖和/或足够快速的冷冻，这些疫苗可以冻干或喷雾冷冻干燥以提高稳定性。另一个问题是铝颗粒可能会形成难以重新悬浮的沉淀物。商业疫苗中的其他佐剂包括化学改性的鼠伤寒沙门氏菌脂多糖的脂质部分（MPL，MPLA）、含有CpG基序的合成寡核苷酸以模仿细菌DNA（例如，CpG 1018®）、角鲨烯和皂苷。这些以各种组合使用，并在某些情况下吸附到氢氧化铝上或作为乳液或纳米颗粒的一部分。所有佐剂的一个共同主题是粒子大小，这是一个具有免疫学后果的属性，可能难以通过制造和质量控制来管理。
6.3.稳定化
在产品配方和工艺开发过程中，确定降解途径以评估制造过程和产品组成变化对稳定性的影响。生物制剂最重要的化学降解途径之一是水解，这通常导致肽键的断裂。其他化学降解途径包括脱水和氧化。物理变化包括亚单位或疫苗的主要方式的聚集和变性或错误折叠。这些分子变化导致产品质量变化，从而导致功能丧失、非目标免疫原性或其他不良反应。分子的一个单一变化可能使其完全无效，这取决于结构受影响的位置。另一方面，一些变化不会有任何影响，因为它们不在与产品活性相关的区域。由于疫苗产品中使用的抗原和佐剂的复杂性，很难理解或预测所有可能的变化及其影响；一般来说，重要的是最小化所有降解。控制或加速降解的因素必须在疫苗产品中得到控制和监测。这些包括产品pH值、氧气水平和水分活性（例如，在固态配方中），它们有助于水解和氧化。通常，高温会加速所有途径的降解。某些缓冲物种、离子强度和微量金属可以影响产品的稳定性。最后，暴露于光线、冻融和暴露于剪切或搅动，引入空气-液体或固体-液体界面的周转，可能会导致产品变化。可以通过添加不同类型的稳定剂来确保产品稳定性，这些稳定剂在配方研究中被识别。最终组成取决于产品类型、降解风险和给药途径。稳定剂包括 cryoprotectants、氧气清除剂和蛋白质；例子包括明胶、PEG和特定缓冲液以管理pH值。给定稳定剂的特定类型和数量可以根据对降解的潜在机制的当前理解来确定。审查用于解决这些问题的不同机制和配方策略的细节超出了本次审查的范围，但感兴趣的读者可以参考其他专注于配方设计和稳定化方法选择的评论（例如，不同的干燥技术）。
一旦产品组成被确定，在整个制造和分销过程中就需要进行环境控制。降低温度，无论是冷藏还是冷冻，都可以保护产品质量。由于许多降解途径可以通过减少水和氧气的存在来限制，产品可以通过冷冻干燥（lyophilization）或喷雾干燥，并引入惰性气体进入顶空来干燥。从历史上看，lyophilization一直是疫苗产品稳定化的主要途径，并且与其他干燥形式一样，对于未来的疫苗产品也很重要（见第6.4节）。
表4总结了疫苗产品的不同平台和所使用的格式类型，以及长期储存条件。一些液体产品不能冷冻，否则会影响产品质量；这对于含有铝佐剂的疫苗产品尤其重要。冷冻条件可以保护那些否则会是溶液/液体基础的产品，但会导致复杂的制造和供应链挑战。干燥产品可以储存在更高的温度下，从而最小化质量风险，但需要重新配制步骤和/或生产稀释液，除非最终剂量形式是固态。
6.4.干燥趋势
干燥的疫苗产品被包装在各种容器中，这决定了最终干燥产品处理所选择的操作。大多数干燥疫苗产品已经在西林瓶中商业化，这增加了全球产能。灌装机非常快速，可以灵活适应不同大小的西林瓶，并且在全球范围内安装。此外，西林瓶灌装设备可以共享于几种液体产品，增加了利用率和对高资本投资的无菌灌装设施的财务回报。冷冻干燥设备已设计为优化单剂量或多剂量单位在玻璃瓶中的生产。然而，对于冷冻干燥产品，可能需要定制稀释液，这使得灌装需求翻倍。额外组件和第二制造操作的需求增加了成本。在患者给药时，两套材料引入了额外的步骤，并增加了临床中出错的风险。为了方便重新配制，已经开发了双室选项。尽管这些产品消除了临床中的转移步骤，但需要额外的制造步骤来在一个室中冷冻干燥并在第二个室中灌装稀释液。
疫苗通常通过皮下注射给药，因此制造的最后阶段必须在无菌条件下进行。容器必须在线清洗和灭菌，或者购买现成的（成本更高）。对于液体和冷冻干燥产品，灌装和塞封是必要的。要冷冻干燥的产品只部分塞封，然后无菌地运输到冷冻、干燥、气体覆盖和完全塞封的柜子中（图7）。已经设计了系统，允许在保持无菌条件的同时，直接从灌装线转移到柜子。对于双室注射器，流程的差异需要特定的设备。图8说明了完成产品制造所需的操作。由于设备专门用于这种类型的产品，利用率可能更难管理。双室产品的成本因组件数量、步骤数量和设备容量的减少而增加。
图7 液体和冻干产品的工艺操作。图片经ATS Scientific Products许可改编。
6.4.1.高级产品干燥技术
干燥疫苗产品的制造技术的进步必须包括上述讨论的新疫苗格式的能力，同时专注于提高生产率和改善质量保证。缩短干燥操作的持续时间为提高生产率提供了重要机会。干燥周期时间的主要限制是水分去除的速率，通常必须降低以保持低产品温度，以防止“回熔”或“塌陷”。塌陷是一种产品缺陷，其中产品蛋糕的结构丢失，这可能会影响稳定性和产品活性。必须控制热量和质量传递，以确保最终产品质量。当前的冷冻干燥柜使用在架子内部流动的热传递流体来冷冻产品并驱动蒸发。对于冷冻和加热，能量必须通过架子穿过玻璃瓶底部并到达产品的整个体积，这可能是低效的。由于热量和质量传递差异，从墙壁、架子之间以及架子上的瓶子位置导致的整个柜子中的不均匀性进一步降低了效率。
改进热量传递，如下面讨论的新颖方法，可以显著缩短周期时间。或者，具有非常低的水的分压的干燥环境可以直接从产品中蒸发水分而不需要直接加热产品。连续生产系统通过提高设备利用率来提高生产率。这一原理可以应用于所有产品类型的干燥，包括西林瓶和双室装置。其中一些技术允许原位干燥，而其他技术则产生必须在适当的剂量下分配到容器中的干燥产品。生产大量干燥产品为开发超出典型西林瓶的新型格式提供了机会，具有更好的稳定性。利用现有原理和西林瓶灌装能力的连续冷冻干燥方法对于西林瓶产品来说将是最简单实施的。
喷雾干燥，其结果是产生球形粒子的干燥粉末产品，是许多先进干燥过程的焦点。对于干燥的散装技术，填充到单位剂量容器中需要粉末填充，这对于非晶态粉末来说可能是具有挑战性的。除了改善喷雾干燥产品的流动性外，还减少了产生细颗粒和外部西林瓶表面污染的风险。过程步骤的数量保持不变，尽管无菌操作的顺序被颠倒（图9）。任何流程改进都必须满足无菌要求，以提供适当的产品质量。设备必须在高度控制的环境中进行灭菌和操作，以保持最高水平的无菌保证；新安装的当前趋势包括尽可能实施封闭系统。所有输入必须在使用点通过无菌过滤或无菌引入作为预灭菌材料进行灭菌。根据设备设计和所需的干预措施确定房间分类。
6.4.2.现场干燥工艺替代方案
现场干燥在最终容器如小瓶和双室注射器中进行，目前是商业产品中最常用的方法。已经对传统冷冻干燥的所有步骤进行了改进研究。冷冻步骤对于允许适当的多孔宏观结构和增强的蒸汽质量传递至关重要。发展重点在于改进成核控制和增加干燥步骤的表面积。通过关注能量传递，可以改进一次和二次干燥步骤，这在当前的冷冻干燥柜中受到通过架子传递到玻璃瓶的热量限制，以驱动蒸发。连续处理可以提高生产力和一致性。
泡沫干燥
泡沫干燥不需要冷冻，并利用干燥过程中的蒸发冷却来维持产品温度。形成的气泡提供了类似膜的表面和高表面积进行干燥；工艺开发重点在于控制气泡的大小和膜的厚度，以确保快速高效的干燥过程。已经证明泡沫干燥技术可以用于疫苗以及生物制药、微生物样本和农产品的保存。
微波真空干燥（MVD）
微波能量可以用来替代架子中的加热流体，在传统的冷冻干燥柜中应用，可以允许继续使用当前的设备。在微波场中快速循环的水分子导致在分子水平或接近分子水平的加热和水的蒸发，而不会显著加热敏感产品。此外，能量可以立即穿透整个系统而不会生成传统冷冻干燥中观察到的局部热和质量传递效应。微波场的频率控制为个别产品在工艺开发过程中的系统优化提供了一个工具。已经证明MVD技术可以用于疫苗和其他生物制药。Bhambhani 等人研究了使用EnWave中试规模系统的MVD，其中产品在小瓶中离线冷冻并转移到FreezeREV®干燥器（图10a）。由于磁控管在干燥室中产生微波提供的能量，因此发生升华。使用干冰冷凝器来冷凝水蒸气，产品小瓶手动加塞。MVD的周期时间比冷冻干燥短87%。早期中试规模研究的结果表明，与传统冷冻干燥相比，水分含量和活性相当。
连续处理
Pisano和同事提出的现场干燥连续工艺如图10b所示。小瓶通过模块移动，每个步骤之间需要特别设计的转移模块以保持适当的压力、温度和气体组成。该系统设计为一个机会，使用传统和熟悉的工艺操作快速连续地生产干燥产品。移动每个小瓶通过冷冻干燥阶段的操作复杂性导致了专注于生产散装干燥粉末。
散装干燥工艺替代方案
虽然混合和研磨通常需要实现小分子或干粉吸入产品的粒径目标，但这些额外步骤对于注射剂并不常见。辅料被纳入喷雾干燥料液中，材料可以直接转移用于粉末填充。如图9所示，散装干燥工艺相对于现场干燥工艺反转了填充和干燥的顺序。这需要完全无菌的粉末或颗粒填充能力（“干填充”）。粉末填充已经存在一段时间来填充无菌抗生素粉末，尽管具有挑战性，但该过程通过改善喷雾干燥材料的流动性而得以实现。颗粒也可以使用粉末填充设备的变体进行填充。散装干燥的一个优点是，散装无菌粉末或颗粒可以填充到几乎所有类型的容器中，包括传统的小瓶和双室注射器，以及不适合现场干燥的新型重构-注射系统。使用散装干燥和干填充可以大幅降低双室注射器的制造成本。已经开发了几种其他方法来解决干填充的问题和挑战。
喷雾干燥
无菌喷雾干燥现在可用，并允许连续干燥和粉末生产。一个例子是Aseptic SD™系统。在喷雾干燥中，含有产品的液体溶液通过喷嘴流动，将产品分散成细颗粒。喷雾干燥的一个优点是通过调整喷雾喷嘴来控制粒径。必须提供无菌气体作为产品干燥的热传递介质；可以使用惰性气体如N2或Ar以限制氧化降解。在喷雾干燥的传统模式中，热气体流经系统以驱动蒸发。气体温度可高达120°C，这可能导致敏感生物产品的降解。然而，系统中迅速发生蒸发冷却以降低产品温度，热暴露时间非常短。这些系统已成功应用于生物生产。另一个系统使用网状雾化器在干燥氮气流中创建球形液滴（图10c）。此外，提供干燥氮气沿膜的逆流以从气体中去除水分。系统在环境温度下运行，以限制对敏感产品的热应力。该技术的概念验证已针对mRNA-LNP产品进行了演示，结果对保持封装效率、粒径和分布以及体外和体内mRNA活性非常好。
喷雾冷冻干燥
也称为“散装冷冻干燥”的喷雾冷冻干燥涉及在含有冷气的塔中液滴冷冻，然后在干燥室中进行真空升华。目前在这个领域存在两个主要的竞争对手，并已成为许多近期评论的主题。第一项技术基于在塔中液滴冷冻，然后在独特的旋转鼓中真空干燥冷冻颗粒。该技术已成功放大，产品产量高达97%。第二项技术是连续喷雾冷冻干燥机，如图10d所示。液滴由喷雾喷嘴产生，并通过液氮冷却的柱子滴落而冻结，从而形成小直径的球形颗粒。冷冻球通过传送带通过不同压力和温度的水平以实现低湿度产品。最终产品直接填充到适当的容器中，该容器以无菌方式密封，用作粉末填充系统的进料。
7.疫苗表征的进展
新疫苗技术平台（例如，mRNA和病毒载体疫苗）的引入促进了分析技术的快速发展，以支持疫苗开发和质量分析。
7.1.生物物理和分析技术
现有生物物理和分析技术在分辨率和灵敏度方面的创新改进，允许对疫苗的纯度和异质性进行更严格的表征，包括灭活或减毒病毒、重组蛋白亚单位和病毒样颗粒（VLPs）以及多糖结合物。这些进步有助于提高对疫苗关键质量属性（CQAs）的定量评估的可靠性，并增强对批次放行的信心。质谱（MS）在疫苗开发中的使用已在之前进行了综述，具体应用实例包括重组蛋白抗原和糖结合物。毛细管电泳（CE）与飞行时间（TOF）-MS联用已用于结核分枝杆菌抗原及其糖结合物的表征。电荷检测质谱（CDMS），即同时检测质量/电荷和电荷，已用于多种类别疫苗和多价疫苗的纯度和异质性的定量。mRNA疫苗技术的显著成功促进了分辨率和灵敏度的改进以及分析方法的创新应用，如毛细管凝胶电泳（CGE）和离子对反相高效液相色谱（IP-RP-HPLC），以评估疫苗结构的完整性和异质性。此外，对多价疫苗的分析在分辨率上变得更加可行。IP-RP-HPLC和MS的结合被用来检测和表征mRNA-LNP配方中脂质片段与mRNA核苷酸的加合物。这些加合物的形成被证明会随着储存时间和温度的函数降低疫苗效力。dsRNA是mRNA产品中的炎症杂质，其水平必须尽可能接近零。虽然已有分析和免疫化学测定方法，但提高灵敏度和通量将有助于过程和产品监测。为此，开发了一种采用微流控技术的CE方法，该方法利用两种不同荧光团对单链RNA和dsRNA的荧光强度差异。动态和多角度光散射（DLS和MALS）技术的分辨率和数据分析的改进，允许精确确定蛋白质抗原、病毒和病毒载体以及LNPs的大小异质性和聚集。mRNA-LNPs的大小分选使研究人员能够确定疫苗配方体内免疫原性与颗粒大小的依赖性。最近的一项创新，基于光散射的质量光度技术，可以确定单个颗粒的大小，从而在一组颗粒中异质性。这项技术被用来研究SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2受体之间的相互作用。新的单颗粒检测方法允许观察溶液中的配方疫苗产品，如mRNA-LNPs，并提供动态视图，与静态电子显微镜（EM）图像相对。最近在溶液中单颗粒成像的创新是凸透镜诱导的限域或CLIC。CLIC是一项有前景的技术，用于可视化和定量分析mRNA-LNP结构、大小以及mRNA疫苗候选物中mRNA装载的异质性。光散射技术的并行进步使得单颗粒大小分析成为可能，与传统的平均集合测量相对。分辨率的改进以及基于模拟和机器学习（ML）的数据分析技术发挥了关键作用。最近开发的可调电阻脉冲传感器（TRPS）方法被用于单颗粒分析，包括生物纳米颗粒如LNPs的大小分布和zeta电位。通过测试不同大小的mRNA-LNPs对体内免疫原性的影响，展示了更高精确度的大小分选的影响（Hassett等人，2021年）。与较大的（100-140 nm）mRNA-LNPs相比，小的（<80 nm）mRNA-LNPs在小鼠中似乎引起了较低的免疫原性，尽管对人类免疫原性的影响尚不清楚。虽然SEC-MALS技术已经建立了二十年，但场流分离（FFF）-MALS提供了基于大小的分离优势，而无需与固体基质相互作用。这项技术被用来关联基于亚单位融合蛋白的呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗候选物的效力变化以及包含封装mRNA的LNPs。BioSAXS最近被引入作为小角X射线散射（SAXS）和SEC-HPLC的组合。与DLS类似，SAXS是一种用于低分辨率结构表征和蛋白质及蛋白质复合物建模的溶液散射技术。BioSAXS被用来确定sa-mRNA疫苗（IMP-1）的半径，与DLS测定的水动力学半径高度一致。冷冻电镜分辨率的显著提高使得可视化充满mRNA的LNPs并确定每个纳米颗粒携带的mRNA结构数量成为可能。这些测量揭示了LNPs中mRNA装载的异质性和给定群体中空LNPs的存在。此外，在一些mRNA-LNP颗粒中，观察到mRNA形成从脂质上脱离的水泡状结构。高分辨率冷冻电镜也被用来确定野生型和突变体S蛋白三聚体的结构，以支持亚单位COVID-19疫苗的开发。无标记检测技术的技术革新为疫苗开发的多个方面做出了贡献，从抗原选择到DS和配方DPs的功能表征。例如，生物层干涉测量（BLI）提供了比表面等离子共振（SPR）更多的优势，尽管这两种技术都提供了大分子和配体之间结合和解离动力学的实时测量。BLI被用来评估SARS-CoV-2 S蛋白RBD三聚体与ACE2受体以及中和人类单克隆抗体的结合动力学和亲和力。
7.2.免疫分析
除了继续使用流行的酶联免疫吸附测定（ELISA）技术外，还开发了一些其他技术，旨在提高检测的灵敏度、精确度、速度和通量。这些平台的例子包括AlphaLisa、VaxArray和Luminex，它们提供了相对容易的多重检测能力。已报道了ELISA和Luminex免疫分析在检测和定量SARS-CoV-2抗体方面的全面比较。多重VaxArray已被用于麻疹和风疹疫苗以及流感疫苗的表征。VaxArray最近被应用于同时快速检测和定量通常包含在肺炎球菌结合疫苗中的23种多糖血清型。在基于抗原-抗体的免疫分析的创新变体中，VaxArray已被用于识别和表征使用互补寡核苷酸作为捕获试剂的mRNA结构。AlphaLisa是一种基于化学发光的高通量免疫分析，已被用于检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白。这些免疫分析可用于细胞培养中，例如，评估细胞转染mRNA疫苗后蛋白表达。由于mRNA、pDNA和病毒载体携带的转基因疫苗的功能取决于编码的蛋白抗原的细胞内表达，免疫分析为这些类别的疫苗提供了宝贵的定量表征。上述较新的免疫分析技术越来越多地被用作诊断工具，用于检测病毒抗原诱导的血清中的抗体。它们还提供了一个平台，用于比较感染和预防性疫苗接种在未感染人群中诱导的免疫反应水平。与高量子产率的荧光团偶联的抗体促进了这些功能事件在基于细胞的分析中的敏感检测和可视化，例如流式细胞术，它利用激光诱导的光散射和荧光检测的组合。荧光显微镜技术的进步也允许可视化mRNA序列转化为相应的蛋白质。
7.3.测序和PCR技术
过去十年中测序技术的进步在多个方面对疫苗的质量测试产生了重大影响。下一代测序（NGS）比Sanger测序的准确性显著提高，使NGS成为测试基于核酸疫苗的身份和遗传稳定性的宝贵工具。NGS被用作一种获批COVID-19 mRNA疫苗的批次放行身份测试（欧洲药品管理局，2021a）。释放疫苗批次的一个监管要求是无外来病毒的存在，挑战在于这些病毒可能是未知的或新出现的。外来病毒的一个主要来源是生产中使用的细胞基质，包括哺乳动物、昆虫和细菌细胞系。主细胞库和工作细胞库（MCB，WCB）应证明无此类外来病毒代理（AVA）。历史上，体内（五种动物）和基于细胞的体外感染性测试已被使用并接受，以确保疫苗的病毒安全性。然而，在过去的十年中，已有大量动力推动用NGS取代体内测试。这些举措许多是由欧洲和美国的监管机构推动的，以及世界卫生组织与生物制药行业和专家顾问合作（欧洲药品管理局，2022年；美国食品药品监督管理局，2023年；世界卫生组织和生物制品标准化专家委员会，2020年）。NGS检测病毒的灵敏度和广度的最新进展、生物信息学和参考数据库的改进、COVID-19大流行突出显示的快速释放疫苗批次的需求，以及减少动物使用的推动，共同推动了这一进展（Charlebois等人，2020年；欧洲药品管理局，2022年；Khan，2021年）。世界卫生组织和FDA分别发布了验证NGS的推荐参考标准病毒和稳定细胞系列表（美国食品药品监督管理局，2023年；世界卫生组织和生物制品标准化专家委员会，2020年）。在过去的十年中，为了取代猴神经毒力测试，作为口服减毒脊髓灰质炎疫苗生产过程中所需的安全测试，以及可能表现出神经毒力的其他病毒，已取得了显著进展，NGS作为一种安全测试（Neverov & Chumakov，2010年；世界卫生组织，2019年）。另一种体外方法，通过PCR和限制酶切割的突变分析（MAPREC），能够检测和定量主要负责神经毒力的逆转变体的频率（Rubin，2011年；世界卫生组织和生物制品标准化专家委员会，1996年）。NGS与MAPREC的比较分析产生了相同的结果。然而，NGS进行全基因组测序和检测低频突变的能力使其成为确保病毒安全性和LAV疫苗生产一致性的更有吸引力的工具。已报道了将NGS验证为新型2型口服脊髓灰质炎疫苗的批次放行安全测试。除了成本和时间优势外，NGS可以取代基于动物的传统测试，具有明显的伦理优势。
水滴数字PCR（ddPCR）技术的引入是过去十年中PCR技术领域的一项极具重要意义的进步。ddPCR是一种高通量且定量的方法，可以应用于准确测定DNA和RNA病毒以及疫苗的基因组拷贝数。ddPCR检测的额外优势在于它不需要标准曲线或参考标准品来进行定量。预计这项技术将在包括pDNA、mRNA、病毒载体和活病毒疫苗（LAV）在内的不同类别疫苗的身份和遗传稳定性测试中得到广泛应用。ddPCR已被验证用于活减毒裂谷热（一种RNA病毒）疫苗开发中的RNA拷贝数定量和检测逆转变体。
尽管分析表征的进步带来了疫苗抗原的高纯度和结构完整性，但宿主依赖的生物学因素常常使得难以预测是否能够在体内激发所需的免疫反应。尽管如此，高分辨率的结构分析辅以免疫分析和突变扫描，已被用来识别对产生病毒中和抗体至关重要的抗原位点。当疫苗效能的主要机制是细胞介导的免疫（CMI）时，这种相关性更具挑战性。然而，最近有报道使用质谱辅助识别HLA呈递的T细胞表位和设计诱导CMI的mRNA疫苗。
8.分析放行检测
分析方法对于疫苗来说是至关重要的基础部分，需要持续监测和更新，以提供最佳信息指导这些产品的发展和制造。分析质量由设计（QbD）为开发稳健的分析方法提供了一条路径，有几篇近期的参考文献详细讨论了这个话题。分析QbD中的概念基于包括ICH Q14在内的指导文件（ICH和欧洲药品管理局，2022年），该文件描述了开发和维护稳健方法的增强方法。将这些指导文件中概述的方法应用于传统方法可以带来显著的收益，但在应用于较旧技术时存在固有的局限性。
SARS-CoV-2疫苗的开发和商业化速度对于未来大流行应对是鼓舞人心的，但为了缩短所有新型预防性疫苗的开发时间，还需要做更多的工作。疫苗制造过程难以控制，最终产品抵抗简单定义和表征。投资于新的和新兴的分析技术将有助于项目更早地生成关键信息，避免在临床开发的后期阶段停滞，并带来更好的产品和过程理解。重要的是开发和建立使用新技术的先例，以最小化风险并允许它们的广泛采用。在分析QbD框架内，在开发分析目标概况（ATP）期间，应深思熟虑地考虑引入新技术。下面讨论了产品独立和产品特定的分析技术的进步。
8.1.产品独立方法
疫苗DS的安全测试包括微生物测试，如无菌性、生物负荷、内毒素、支原体和外来因子测试；其中许多由药典权威详细描述（美国药典[USP]、欧洲药典[PhEur]、日本药典）。这些方法的优点是已经建立和理解，但可能非常费力和耗时，此外还引发了关于动物使用的伦理关注。最近的指导（欧洲委员会，2022年；美国食品药品监督管理局，2020年）鼓励考虑传统方法的替代方法。来自FDA的，“如果赞助者提供足够的测试特异性、灵敏度和稳健性信息，接受与USP、FDA指导或联邦法规（CFR）中概述的不同分析程序在IND下是可以接受的。”同样，附件1指出，“制造商应考虑采用合适的替代监测系统，如快速方法，以加快微生物污染问题的检测，并降低产品风险。”
纳入新的、快速的微生物方法的势头正在增强，部分原因是对COVID-19大流行的响应，以及细胞和基因治疗产品的需求，这些产品许多都有非常短的货架寿命。由于样本大小和生长条件，传统的基于生长的无菌性评估方法的局限性是众所周知的。BacT/Alert 3D系统已作为验证的无菌方法加入了药典14天基于生长的无菌性测试；其他一些基于生长的测试和一些不基于生长的测试正处于不同的开发阶段。基于PCR和ELISA的检测方法现在已被广泛接受用于支原体的检测，基于NGS的方法也在开发中，如在疫苗表征进展部分所述。外来因子测试需要能够检测广泛可能的污染物的方法。新技术，如激光力细胞学，正在被探索以识别细胞病变效应并改进经典的基于细胞的检测。NGS技术不仅对于检测微生物污染物具有重要意义，也有望取代目前用于检测外来病毒代理（AVA）的一系列体内、体外和PCR测试。
8.2.产品特定方法
除了药典放行检测外，疫苗还需要测试特定于正在开发的疫苗的身份、强度、纯度和效力等CQA（关键质量属性）。传统用于这些属性的方法存在局限性，而新兴技术在许多情况下可以减轻这些局限性。疫苗效力方法多种多样，以满足它们将提供有关患者期望的免疫反应信息的期望。体内效力测定充满了变异性、不可复制性和与基于动物的测定固有的长周转时间。因此，出于这个原因，以及考虑到动物福利和成本，体外测定的开发在疫苗的特性描述和批量放行中变得极为重要。理解疫苗的作用机制（MOA）仍然是开发最相关效力测定的关键，但与以往相比，开发科学家现在有更多的工具可供使用。在确切的保护性免疫反应的性质未知的情况下，新技术正在提供更丰富、更精确的信息，说明疫苗的基本工作原理。在某些情况下，抗原与佐剂的相互作用以产生期望的免疫反应仍无法通过当前的方法和知识进行评估。斑点测定法几十年来一直是活病毒疫苗的病毒学主力，但近年来科学技术的进步可以作为增强和/或替代病毒定量方法，如传统的斑点和TCID50方法。荧光成像技术在分辨率和定量精度方面的提高有助于用自动焦点计数替代传统测定。在细胞单层中识别斑点或细胞病变效应（CPE）可以被PCR、激光力细胞学和细胞电阻抗等替代。在佐剂的存在抑制了这些技术的使用的情况下，微生理系统显示出作为模型系统的潜力，用于将疫苗效力与体内效力相关联。使用这些系统也可能提供一种评估旧疫苗和工艺变化影响的方法，而无需使用临床前动物模型或临床试验。蛋白质亚单位和VLP疫苗通常依赖于体外效力的抗原性测定。基于AlphaLisa、荧光能量转移（FRET）、Luminex和电化学发光等技术的测定与标准ELISA方法相比，在速度、灵敏度、动态范围、数据密度和多重能力方面具有优势。除了基于蛋白质的疫苗外，免疫测定也被用于开发新技术的疫苗，如mRNA，其中最终的抗原是蛋白质。例如，人类狂犬病疫苗，已开发出基于包膜糖蛋白的ELISA和时间分辨免疫荧光，以及全细胞百日咳疫苗ELISA，显示出有望替代当前使用的体内Kendrick测试。流式细胞术，假定使用荧光标记的抗刺突蛋白抗体，被用于首个获批的COVID-19 mRNA疫苗的效力测定（欧洲药品管理局，2021a，2021b）。在没有特定的免疫测定用于效力测量的情况下，可以开发与效力相关的结构和功能测定作为替代品。监管机构对这一概念的开放性在2021年作为mRNA疫苗开发指南发布的WHO生物标准化专家委员会报告中得到了体现。实际上，这样的替代测定已被接受用于表征双价mRNA COVID-19疫苗的疫苗效力（欧洲药品管理局，2021b）。作为对旧技术的纯度和完整性分析的进步的一个例子，毛细管电泳（CE）已经发展成为SDS-PAGE和免疫印迹技术的优越替代品，提供了极大的工艺和产品理解改进（Geurink等人，2022年）。同样，质谱（MS）显示出改进传统基于ELISA的HCPs（宿主细胞蛋白）检测方法的潜力。SARS CoV-2疫苗的开发和放行测试为未来的大流行疫苗铺平了道路，也提供了有望减少预防性疫苗开发时间表的方法。
9.工艺监测分析
最近的COVID-19大流行突显了实时或快速放行疫苗批次以最小化可预防死亡和痛苦的需求。此外，在GMP生产DS或DP的最后阶段，如果一个批次未能满足放行规格，可能会造成极大的成本。因此，通过每个步骤的在线或现场测试监测工艺对于确保最终产品的高质量和快速放行至关重要。每个正在开发中的新疫苗通常都有一个明确定义的质量目标产品概况（QTPP）。生物工艺优化以达到目标QTPP的概念已在支持mRNA DS工艺的分析数据中得到描述。这一基本原则与在所有平台上开发所有生物制药产品的QbD原则的实施相关。应监测制造工艺步骤，以保持所需的效力的抗原表位。在许多情况下，提高了在细胞基质存在下测量效力的能力，使这成为可能，从而避免了工艺失败并允许优化。例如，通过“流病毒测量”在线监测缺陷病毒颗粒，结合基于激光力细胞学的效力测量，已被用于改进LAV疫苗制造工艺。与监测细胞密度和峰值感染的电容工具和高含量成像相结合，这些过程分析技术（PAT）工具可能共同为LAV疫苗提供效力测定替代品。
近期对PAT（过程分析技术）在生物工艺中集成的好处进行了回顾。拉曼光谱、核磁共振（NMR）、近红外和中红外（IR）光谱以及动态光散射（DLS）作为PAT工具的使用日益增多，因为这些生物物理测量提供了与功能相关的结构信息。核磁共振光谱在优化肺炎链球菌疫苗抗原的纯化工艺开发中的荚膜多糖质量方面具有重要价值。核磁共振被用来监测在开发针对b型流感嗜血杆菌和脑膜炎球菌A亚群的结合疫苗过程中多糖的三级结构。动态光散射和其他光散射技术多年来一直被用于监测亚单位和VLP疫苗的聚集和多分散性，并优化纯化和配方条件以防止聚集引起的效力损失。最近，动态光散射被用来选择相对单分散的、尺寸适宜的LNPs群体，用于mRNA-LNP疫苗。这些信息有助于控制mRNA DP工艺开发中的微流体混合参数，特别是流速。随着mRNA DS和DP的QbD驱动的连续制造工艺的进一步开发和优化，PAT将继续发挥重要作用。
10.疫苗制造监管环境
为了鼓励疫苗制造的创新，美国卫生和公众服务部于2021年1月19日发布了《2021-2025年国家疫苗战略计划》（美国卫生和公众服务部，2021年），该计划更新自2010年的国家疫苗计划。在2021-2025年疫苗计划中，几个主题仍然处于前沿，包括疫苗供应和大流行应对、改进的质量测试程序、全球监管协调以及发展中国家制造商参与疫苗供应。2021-2025年疫苗计划有五个主要目标，前两个涉及提高疫苗生产和安全性：（1）促进疫苗开发、制造和相关技术的创新；以及（2）保持尽可能高级别的疫苗安全性。第一个目标在本综述中进行了讨论，但第二个目标是由政府监管审批流程的演变和行业过程控制系统的创新驱动的，主要是当前的GMP和QbD。监管审批流程的存在是为了确保患者安全。对COVID-19大流行的快速响应为监管流程完成的速度树立了新标准（11个月），并让许多人思考我们是否可以在保持相同患者安全保证的同时，缩短所有疫苗候选物的市场上市时间。COVID-19疫苗的加速时间表是由行业和政府投资风险（数十亿美元）、全球共享基因组序列、先前的冠状病毒研究、数十年的mRNA疫苗开发工作、监管接受在风险上进行药物开发的决定、无缝临床试验和监管机构的快速审查所驱动的。有些因素在非危机情况下无法复制，但其他因素可以缩短当前的发现到市场疫苗开发时间表，即10-15年（Anderson，2022年）。大流行前，一些监管工具已经存在以增加灵活性，如FDA的EUA和EMA的CMA，以及FDA的快速通道指定和EMA的滚动数据提交。在大流行期间，对标准做法的调整加速了批准，包括依赖其他机构的检查和审查（依赖途径）、动态/滚动/实时审查、额外的机构指导、对数字化和电子标签技术的接受增加、减少纸质文件以及放宽对单个批次放行测试和当地临床数据的限制。依赖途径是一种基于风险的监管提交方法，涉及认可其他当局和机构的数据、评估和/或决定。虽然这在某种程度上一直在发生，但大流行鼓励了数据共享以加速疫苗开发。国际药品监管机构联盟（ICMRA）COVID-19工作组创建了一个所有COVID-19主协议的列表，以通知政策讨论并收集有关监管灵活性的知识（国际药品监管机构联盟，2022年）。ICMRA还与国际协调会（ICH）、国际药品监管机构计划（IPRP）和药品检查合作计划（PIC/S）合作，以开发药品质量知识管理（PQKM）能力（国际药品监管机构联盟，2023年）。还创建了公共和私人实体之间的合作，包括获取COVID-19工具（ACT）加速器以“加速开发、生产和公平获取COVID-19测试、治疗和疫苗”（世界卫生组织，2022年）和COVID-19证据加速器（EA）以共享真实世界证据（RWE）。一些当局还使用依赖途径来缩短评估过程并加快其国家的审查过程。一些国家监管当局接受药品证书（CPP）已缩短时间表，而EMA的一个名为“OPEN”的试点项目使国际机构能够参与其科学评估过程（需要保密安排），这促进了透明度和共同挑战的解决。
基于风险的方法，如依赖路径，也可用于加快批准后变更（PACs）。制造商和监管机构之间共享的批准后变更管理协议（PACMPs）允许快速实施变更，而宽限期和/或豁免允许PACs迅速获批并可供患者使用（IFPMA，2022年）。依赖路径在中低收入国家（LMIC）尤其重要，这些国家的机构可能没有足够的成熟度和能力来处理健康紧急情况。
审查流程中的主要范式转变是将提交内容分解为更小的包装进行分段审查的概念，而不是在活动结束时提交完整的档案。数据可以在约定的里程碑上呈现或实时呈现。在某些情况下，这些间歇性的数据包可以与下一步的启动同时审查，有时被称为分阶段或滚动式监管审查。一个例子是欧洲制药工业和协会（EFPIA）及其动态监管评估（DRA）的概念，该概念涉及在完整的市场授权申请（MAA）之前，尽早提交数据包。
在大流行期间，EMA和FDA提供了额外的指导和与制造商的持续对话，作为加快开发和审查时间线的方法。例子包括EMA的优先药物（PRIME）计划，该计划发布了补充问答文件，讨论了新的指导和早期开发计划，以及FDA和EMA提供的目标产品概况和详细要求。这些信息在大流行之前并未提供。
数字化提高了COVID-19大流行期间监管活动的连续性，并改善了所有利益相关者之间的互联性，特别是由于虚拟会议和在线平台。电子文件、电子签名和电子提交的使用通过减少旅行和纸张的需求，推进了可持续性。结构化数据集的使用，既适用于人类也适用于机器阅读，正在迅速推进，这使得自动化和基于云的平台的效率得以提高。生成式人工智能（Gen AI）也将不可避免地在监管审批过程中发挥作用。麦肯锡公司最近的一份报告提出，Gen AI支持的智能引擎将通过预测潜在的健康当局查询（HAQ）模式，快速起草回应，并通知可能减少HAQ后续跟进的提交策略，显著提高撰写提交文件和回应健康当局查询（HAQ）的效率。报告还表明，Gen AI可以作为主要的提交内容撰写者，特别是基于协议、数据和统计分析计划起草临床研究报告，以及创建表格和图表。医学作者将被释放出来，专注于需要更复杂临床解释的部分，改善团队间的合作，降低成本，并限制质量问题。
数据类型和共享方法的协调对于提高时间线至关重要。基于云的系统有潜力简化并行机构审查和依赖。ICH和ICMRA等论坛可以帮助促进这一点，并与利益相关者合作，避免出现碎片化或冲突的系统。在大流行期间使用的额外灵活性可以应用于未来的疫苗计划，包括创新的临床试验策略（例如，平台方法同时在临床测试多个候选者），使用历史数据进行预测分析，利用来自其他试验的真实世界数据或安慰剂/标准护理数据，以及虚拟检查，这些已经获得接受，并可以减少与安排和旅行相关的延迟。其他选项包括放宽对单个批次放行测试的限制（例如，豁免重复批次放行/当地测试要求），豁免当地临床数据的要求，以及豁免特定国家标签语言/艺术/细节的要求，包括接受包装上的QR码（电子标签）代替物理传单。这些灵活性中的每一个在每种情况下可能都不可能；例如，由于缺乏技术，LMICs中使用电子标签可能不可行。总体而言，这些类型的监管思维转变有潜力彻底改变历史工作方式，这将提高效率和时间线，而不会牺牲质量、安全性和有效性。
除了过去十年实施的监管创新和灵活性之外，制造商的过程控制策略也取得了进展。如本节开头所讨论的，2021-2025年疫苗计划的第一个目标是促进疫苗开发、制造和相关技术的创新，这可以通过两个主要途径实现。在高层次上，CMC和cGMP都是过程控制策略（美国食品药品监督管理局，2022年），目标相同，即确保产品始终满足既定的质量要求，但它们的范围有所不同。CMC信息特定于产品，而cGMP是整个制造商运营的高层次框架。CMC需要对产品质量的细节给予细致的关注，并涉及定义CQA及其相关的CPP。一旦这些被识别，就可以为过程和产品规范定义一系列活动，以确保批次间的一致性。CMC计划将通过产品生命周期的每个阶段，通过产品组件、设备、制造条件、记录和人员的全面控制来展示。另一方面，cGMP是一套高层次的质量保证活动和指导方针，定义了产品规划和开发以及设施设计和运营。cGMP计划包括文件、设备、培训和设施的维护，其中可追溯性是一个基本组成部分。CMC和cGMP系统经常交叉且不互斥，两者对产品成功都至关重要。同步CMC和cGMP计划可能很复杂，方法可能因产品和制造商而异。
过去十年中，CMC和cGMP领域从创新中受益匪浅，例如人工智能（AI）和机器学习（ML），它们可以自动化数据分析、流程优化和质量控制等任务。大数据分析是强大的工具，可以用来识别趋势并改善决策制定。3D打印技术赋予了快速创建产品和设备的原型前所未有的能力，加快了开发过程。甚至像虚拟现实（VR）和增强现实（AR）这样的技术也被用来培训员工和模拟流程。一个经常被忽视的进步是网络安全，这对于保护知识产权和数据免受网络攻击至关重要。
在计划和执行方面的改进减少了向发展中国家新兴制造商转让技术的周期，这有助于全球可获得性和负担得起的重要疫苗，如b型流感嗜血杆菌结合疫苗。在大流行之前，典型的疫苗技术转让需要27-29个月，因此缩短这一周期对于迅速向全球人口供应COVID-19疫苗至关重要。控制塔式的技术转让方法涉及一系列定义好的事件和会议，确保有效沟通，特别是迅速将问题升级至领导层，这种方法越来越受欢迎。其他敏捷的工作方式包括非等级制的高效决策、早期风险容忍投资、快速产能提升、在负面结果出现时的灵活性、确保跨学科团队成员中的高水平专业知识、在不同职能和公司之间使用共同词汇，以及将质量要求视为推动者而非障碍。行业、组织、监管机构和政府政治组织之间的合作和伙伴关系变得至关重要。
要使国际技术转让成功，必须动员现有能力，建立新的能力，协调制造和监管流程，并分配资源——这些活动需要政治上的支持。
CMC和cGMP中的另一个思维转变是集中化与分布式制造模式的概念。传统上，疫苗是在集中地点生产的，这是由于技术转让到其他地点的高成本经济驱动的。另一方面，分布式制造将产品生产更接近最终用户，这在大流行期间是有用的。由于流程平台，建立多个地点的流程变得更加可行，但批准每个地点的广泛监管要求仍然是一个障碍，以及当地测试和质量保证。尽管分布式制造无法提供与集中生产相似的规模经济，但灵活制造技术和监管流程的进步可能使这种方法在未来更加可行。
质量源于设计（QbD）涉及创建一个设计空间，这是一个多维组合的CPP和CQA，已经证明可以保证质量。为RNA疫苗合成生物反应器开发了一种迭代方法来创建生物过程QbD空间（图11）。在大流行的情况下，快速响应至关重要，存在一个与疾病无关的平台流程，并且有一个已建立的QTPP驱动的设计空间，将使团队能够在原材料可用时立即生成材料。从理论上讲，在强大的设计空间内的过程变更不需要额外的监管提交，从而创造出更具灵活性的过程。QbD框架可以用来支持生产流程的开发和运营，并可以遵循迭代开发周期，这将在整个生命周期中提供持续改进。
11.结论
在过去几年中，疫苗开发能力取得了显著进步，这在对COVID-19大流行的加速响应中得到了体现。mRNA和复制缺陷型腺病毒已被确立为可以相对快速开发并规模化生产数十亿剂疫苗的主要新平台，且成本合理。在COVID-19疫苗的快速开发中，安全有效的疫苗的开发速度超出了所有预期。
其他疫苗平台，如蛋白抗原和减毒活疫苗（LAV）仍然很重要，相关的技术进步已在本综述中强调。我们预计，基于生物学的进步和对疾病的理解，疫苗开发将进一步取得惊人进展。
在连续制造、一次性流程、无细胞技术、过程分析技术和放行检测方面的疫苗制造创新正在降低成本并提高效率。正在进行的创新也在取代传统的批量放行测试，以消除动物测试的需求。本综述中对疫苗分析进步的详细总结是有意为之；在过去十年中，这一领域经历了巨大的技术飞跃，影响了疫苗制造的各个方面，导致一致性、生产力、产品质量、产品测试速度和运营规模的改进（Buckland等人，2022年）。
近年来，已在设计和开发旨在引发T细胞介导免疫反应的疫苗方面做出了重大努力。这一新兴领域有望提供针对HPV、HIV和癌症等传染病的有效预防和治疗性疫苗。也在努力开发提供针对流感和SARS-CoV-2广泛亚型的基于T细胞的mRNA疫苗，并延长与当前基于mRNA的COVID-19疫苗相比的保护持续时间。基于肽的针对T细胞的COVID-19疫苗也在早期临床开发中，支持开发和免疫原性评估的分析方法和检测正在进展中。
随着疫苗和疫苗接种从预防应用发展到治疗应用，疫苗领域进步的机会范围进一步增加，这得益于对目标疾病的快速和详细分析。我们预测，进步将在未来十年内继续以快速的步伐进行，导致新疫苗能够以合理的成本迅速在全球范围内提供，这得益于设计、技术和分析的创新。
