摘要
植物对硝酸盐、磷酸盐和蔗糖的反应形成了一个对陆地适应至关重要的复杂分子网络。然而，在植物陆地化过程中，该网络的起源、功能多样性和进化能力仍然知之甚少。在这里，我们比较了苔藓植物 Marchantia polymorpha 和链藻 Klebsormidium nitens 对这些营养物质的转录组反应。我们表明，主要物种特异性的营养反应模式是由基因调控网络 （GRN） 改变驱动的。有趣的是，虽然控制 GRN 的途径表现出适度的保守性，但 M. polymorpha GRNs 通过重新部署古老的转录因子 CSD 表现出更多的调节连接。在 M. polymorpha 中，功能分析揭示了预先存在的细胞分裂素机制参与下游靶标，协调对营养状态的可塑性形态生理反应。我们的研究结果表明，遗传共选择事件有助于陆地植物的成功建立。
主要
陆生植物，也称为胚生植物，是从 ~500 亿年前的一组链藻进化而来的1,2.它们的出现标志着地球历史上的一个关键事件，使所有生物界都能在陆地上创造宜居环境。然而，这种从水生栖息地到陆地栖息地的过渡给胚胎植物的藻类祖先带来了许多挑战——与相对同质的水生栖息地不同，陆地生态系统中的营养分配本质上是异质的3.这种异质性需要形态生理特征的创新，这在生根结构的发展及其感知和适应养分波动的反应中很明显。促进这一点的是分子机制的类似发展，与叶绿藻和链藻（包括钼生藻，如麝香藻）相比，陆地植物中营养信号基因的显着扩展和多样化反映了这一点4和 Zygnema circumcarinatum5它们是陆地植物的近亲6（图 .1a）。
a，参与陆地植物和藻类谱系营养信号传导的蛋白质的系统发育分布。圆圈的大小表示基因的数量。b，用于 RNA-seq 分析的营养处理样品采集的实验设计概述。c，d， 来自 M. polymorpha （c） 和 K. nitens （d） 的时程转录组的主要基因表达簇。这些簇以对数形式可视化表达式动态2fold-change （对数2FC） 在指定的营养饥饿-再供应时间过程中。在每个簇谱中，左上角的数字表示簇编号，重要的簇以红色突出显示，而底部的数字表示分配给每个簇的基因计数。e，跨物种成对聚类重叠分析。显著性在热图中表示为逐渐的绿色刻度。f，显著重叠集群中一对一直系同源物的丰富 GO 词云。字长与 FDR 值成正比。
氮、磷和糖/碳是影响植物生长和生产力的关键常量营养素和能源。它们是各种生物分子（如核酸、蛋白质和一些植物激素）的基本组成部分。除了它们的营养功能外，硝酸盐 （NO3−）和磷酸盐 （Pi） 是植物氮和磷的主要来源，以及蔗糖 （Suc，陆地植物中糖的运输形式）是被特定转导器感知和转导的重要信号分子7,8.陆地生态系统通常表现出多种营养元素的伴随限制，需要对 NO 做出高度协调的反应3−/Pi/Suc 可用性。因此，陆地植物，至少是被子植物，已经进化出相互交织的复杂网络，以优化这些营养物质的吸收、运输和同化9、10、11、12、13.在陆生植物的长期进化过程中，已经建立了许多调控网络，其中许多转录因子 （TFs） 发挥着重要作用14、15、16、17 元.此外，这些错综复杂的网络涉及多种激素信号通路，能够微调生理和发育反应，这有助于植物适应不断变化的陆地环境。
这些新的生理和发育特征在早期陆地植物中的出现可能是由各种分子进化模式驱动的，包括基因出生、复制和共选18,19.基因诞生为现有的分子系统引入了全新的功能，尽管成功从头产生功能基因的可能性有限。基因复制允许复制的基因继续与基因调控网络 （GRN） 中的现有相互作用者一起发挥作用，同时也为通过累积突变出现新功能提供了机会，这被称为新功能化。另一方面，共同选择重新利用部分或全部预先存在的遗传元件及其调节结构，在没有新遗传材料创新的情况下加速进化适应。虽然广泛的进化对于植物群在陆地上繁衍生息和适应不同的环境可能是必不可少的，但分子进化模式以及 GRN 的起源和功能分歧仍然难以捉摸。我们通过比较 Marchantia polymorpha 和 Klebsormidium nitens 中对硝酸盐、磷酸盐和碳（蔗糖）的时间序列转录反应来解决这些问题。K. nitens 是一种非常适合用于功能研究的链藻藻模型，因为它具有陆生植物特有的关键特征，例如抗逆性，并在实验室中显示出广泛的栖息地适应和旺盛的生长20、21、22 元.结果表明，在 M. polymorpha 中，通过预先存在的 GRN 和细胞分裂素反应机制的共同选择，有效的营养获取进化而来。M. polymorpha 中的核心转录因子 MpCSD 、 MpHD9 和 MpERF20 已将其直接靶标扩展到细胞分裂素反应，在磷酸盐和硝酸盐缺乏的情况下促进器官间通讯和协调反应。GRN 的多样化和共同选择事件对于在陆地上成功建立植物可能至关重要。
结果
M. polymorpha 和 K. nitens 对营养物质的不同反应
苔藓植物和气管植物（维管植物）在陆地化后与它们的共同祖先分化，而链藻类，特别是 Zygnematophyceae，是陆地植物的近亲，在陆地化之前分化。为了阐明营养反应的保守和不同的机制，我们比较了链藻 K. nitens 和苔藓植物 M. polymorpha 之间的时程转录组谱。两个物种均用 NO 处理3−、Pi 或 Suc 缺陷培养基（推荐 NO 的 1%3−、Pi 或推荐 Suc 的 0%），随后重新供应未经改性的全强度营养培养基长达 72 小时（图 D）。这在多形形分枝杆菌中产生了 1,1-064,2 个差异表达基因 （DEG），在成对比较中产生了 805,1-593,4 个差异表达基因 （DEG），在尼氏克雷伯菌中产生了 250,<>-<>,<> 个 DEGs（例如，NO3−饥饿 vs 对照，6 小时 NO3−补给 vs 否3−饥饿，如图 1 所示。1b;每个成对比较中的 DEG 数量显示在扩展数据图 <> 中。<>c，d）。在这两个物种中，NO 的3−，观察到 Pi 和 Suc 饥饿反应基因（扩展数据图 .1c，d），表明一种调节每株植物内三种营养反应的协同机制。在 M. polymorpha 中，转录组谱通常在营养补充后 72 小时内恢复到最初的未处理状态（扩展数据图 .1a，c，e）。这与水稻和拟南芥的报道一致23,24.然而，在 K. nitens 中，大多数饥饿反应基因是不可逆的，保持从饥饿期到随后的再供应期的表达水平（扩展数据图 .1d，e）。这表明在研究的时间过程中，由营养饥饿触发的 K. nitens 细胞状态的不可逆转变（图 D）。1b）。
为了比较 K. nitens 和 M. polymorpha 在营养饥饿和再供应过程中的表达动态，根据它们的表达谱对 DEGs 进行了聚类（补充图 D.总体而言，每个物种内的 DEGs 被分为 1 到 7 个显著簇（Bonferroni 校正的 P < 13.0，排列检验），无论营养类型如何，都具有相似的模式（图 D）。05c，d;标签为红色）。在 M. polymorpha 中，确定了三种主要模式：（1） 营养饥饿下调，但在补给过程中上调（深橙色簇）;（1） 养分供应期间下调（集群 2 和 19）;（20） 营养饥饿上调，但在再供应过程中下调（深紫色簇）。在 K. nitens 中，DEGs 主要分为另外三种主要行为：（3） 在营养饥饿-供应期间持续的基因上调（浅橙色簇）;（1） 养分供应期间下调（聚类 2）;（19） 在营养饥饿-再供应期间持续的基因下调（浅紫色簇）。基因本体论 （GO） 术语（补充图 3）。2） 在不同簇的所有类型的营养胁迫下，M. polymorpha 和 K. nitens 均鉴定出与光合作用、DNA 代谢、离子转运和初级代谢调控相关的基因。值得注意的是，与纤毛相关的生物过程（对应于植物中的鞭毛）在 K. nitens 中独特发现，这种现象类似于氮剥夺下的单细胞绿藻衣藻25.虽然 K. nitens NIES-2285 在营养阶段没有表现出鞭毛细胞并且缺乏运动能力，但在 GO 分析中注释为纤毛/鞭毛的基因可能与类似于其他藻类的向生殖阶段的过渡有关26.相反，与植物激素相关的 GO 术语（例如对细胞分裂素的反应）仅存在于 M. polymorpha 中。
如果调节机制保守，直系同源基因在治疗下往往表现出相似的时间反应模式。为了确定这些时间模式的守恒性，我们使用一对一的直系同源物进行了成对聚类比较。总体而言，只有 8 个具有相似表达模式的簇对（簇 16 与 16、18 与 18 和 19 与硝酸盐中 20;磷酸盐中 16;9 与 8、16 与 18、18 与 18 和 19 与蔗糖中 20）显示出显著重叠（图 D）。1e）。所有其他具有相似模式的对都没有显示出明显的重叠，这与它们的 GO 项重叠不良一致（补充图 2）。相反，主要在具有不同表达谱的簇之间观察到显着重叠，表明 M. polymorpha 和 K. nitens 之间的营养反应机制的保守性有限。出现在这些显着重叠的簇中的直系同源物与光合作用和细胞周期调节等家务功能的 GO 术语相关（图 D）。1f），与衣藻中的相当27,28，表明涉及基础代谢的营养胁迫反应在绿色植物中是保守的。
一些已识别的集群也可能与其他压力反应有关。参考29在不同温度和光线下对 Zygnematophyceae 藻类 Mesotaenium endlicherianum 进行了转录组分析。Jaccard 相似性指数显示，M. endlicherianum 中的一些共表达模块与本研究中鉴定的 K. nitens 簇 43 和 M. polymorpha 簇 16/18 相似（以虚线框突出显示，补充图 33a，b）。与这些簇中的直系同源基因相关的 GO 术语与光合作用和能量代谢有关（补充图 <>）。<>c，d），这些也在 M. endlicherianum 研究中被发现29，表明不同物种和刺激的共同环境响应机制。
营养 GRNs 在 M. polymorpha 和 K. nitens 之间发生改变
转录动力学与基因调控网络 （GRN） 的改变同步进化。因此，我们比较了 GRN 和 NO 排名靠前的 TF3−、Pi 和 Suc 对 M. polymorpha 和 K. nitens 的反应（图2）. 这些 NO3−，Pi 和 Suc 网络表现出高度相似的顶级 TFs，但为每个物种量身定制，它们可以作为每种植物养分反应的一般主调节因子。在 M. polymorpha 中，排名靠前的 10 个 TFs 中有 6 个与 NO 共享3−、Pi 和 Suc 网络（图 D）。2 个 TFs 还表现出对一些非生物胁迫（如光和温度）的响应30（补充图4），暗示它们在应对 M. polymorpha 的环境线索方面的多功能作用。在六个推定的主调节因子中观察到靶基因的相当大的重叠（补充图 5）。20），特别是在 MpCSD 、 MpERF9 和 MpHD2 中，表明它们在营养反应中的协调作用。相反，预测其他主 TFs MpAP3L1 、 Mp17RMYB13 和 MpbHLH<> 会影响不同的靶基因集，这意味着它们对营养响应的不同方面的调节。
a， 响应 M. polymorpha 中硝酸盐、磷酸盐和蔗糖的基因调控网络。方形节点代表转录因子，圆圈描绘它们的靶基因，边缘表示推断的调节关系（参见方法）。蓝色、橙色和红色边缘分别突出显示了 MpCSD、MpHD9 和 MpERF20，它们被选中用于后续功能验证。在各自的功能丧失转录因子突变体中被错误调控的基因被覆盖回网络上，并表示为黑色圆圈（参见后面的功能丧失分析）。b， K. nitens 的基因调控网络。颜色匹配的边缘表示来自同一基因家族的转录因子，通常在硝酸盐、磷酸盐和蔗糖条件下观察到。为简单起见，此处说明的网络仅限于前 1,000 个原始输出和前 10 个转录因子中的边缘。
在 K. nitens 中，C3H 家族 TF （基因 KFL_005440010） 在所有三种情况下通常作为排名靠前的 TF 出现。此外，一些排名靠前的调节因子属于相同的 TF 家族，例如 C2H2 和 Homeobox 结构域 （HB）。在某种程度上，这可以通过 C2H2 家族 TF 在漫长的进化时间尺度上的巨大 DNA 结合域变化来解释31.在 M. polymorpha 和 K. nitens GRNs 中排名靠前的 TFs 中，一个具有最接近的同源关系 （MpHD9 和基因KFL_000270440，由互惠最佳 Blast 命中和系统发育关系定义;补充图。5 和 6），表明遗传共选对营养 GRN 在深时间的进化也至关重要。
M. polymorpha 主 TF 突变体的营养敏感性较低
6 种 TFs 在 NO 中的生理作用3−、 Pi 或 Suc 反应性接下来通过生成功能丧失突变体来检查。其中，Mpcsd、Mperf20 和 Mphd9 突变体改变了营养敏感性（补充图 D）。7 和扩展数据图Mp erf2 和 Mphd20-9 突变体显示出与野生型 （WT） 相当的菌体大小，而 Mphd36-9 和 Mpcsd 突变体在我们的标准生长条件下显示出更小的菌体（图 D）。图 14a，b 和扩展数据图开花植物中的硝酸盐缺乏会诱导蛋白质和叶绿素色素的降解，从而导致叶片衰老。在 NO 下3−饥饿时，与 WT 相比，所有突变体都显示出更高的叶绿素指数（图3a，c）。在 Pi 限制制度中，开花植物往往会在叶子中积累花青素。在这里，M. polymorpha WT 植物积累了更多的 auronidin，这是一种由苯丙烷生物合成分支形成的独特红色色素，与导致花青素的分支不同32，比 Pi 饥饿下的所有突变体都要多。总的来说，突变体对营养缺乏的较低敏感性表明这些 TFs 在调节 M. polymorpha 的营养反应中起着关键作用。
a，WT 和突变植物在完全（对照）、硝酸盐或磷酸盐缺陷型 Yamagami 培养基中生长 2 周的代表性图像。比例尺，5 毫米。其他独立突变株系的图像显示在 Extended Data Fig 中。2.b-d，WT 和突变植物的菌体面积 （b） 和叶绿素 （c） 以及 auronidin 指数 （d） 的定量。在c和d中，n= 5（左面板和中面板）;n= 10 （对于 Tak-1，右图），n= 5 （对于突变体，右图）。箱线图显示中位数（中心线）、第 25 到第 75 个百分位数（箱线）和 1.5× 四分位距以及数据的最小-最大分布（须线）。统计学上显着的差异用不同的字母表示（双向方差分析，Tukey 的 HSD 事后检验;P< 0.05）。星号表示使用双尾t检验确定的显著差异，使用 Bonferroni 方法调整P值;**P< 0.01， ***P < 0.001;NS，无意义。
细胞分裂素信号传导在 TF 主突变体中受损
为了揭示在突变体中观察到的表型变异的分子基础，我们对 Mpcsd、Mperf20和 Mphd9突变体以及 WT 进行了 RNA-seq 分析。WT 和每个突变体之间的 DEGs（错误发现率 （FDR） < 0.001）代表由各自 TFs 调控的基因，其中包括在我们的 GRN 分析中确定的许多直接 TF 靶标（在图 .总体而言，很大一部分 DEGs 在三个突变体之间共享，尤其是在 Mphd2和 Mperf9之间，其中超过 20% 的 DEGs 是共同的（图 D）。50a，b），证实了我们的 GRN 分析，其中三个调节因子共享最多的推定靶基因（图 D）。这表明MpCSD、 MpERF4和 MpHD2调节相同信号通路下游的基因表达。此外，这些 DEGs 在使用表达动力学定义的主要簇中显著富集（图 D）。20c和扩展数据图9b），支持它们在转录营养反应中的功能。Mpcsd包含最多的 DEGs，与其强大的表型一致。在其 1,2 个 DEG 中，分别有 4.254% 和 37.5% 与 Mperf41和 Mphd5重叠（图 D）。相比之下，Mphd20（9.4%） 和 Mperf9（66%） 中较大比例的 DEGs 也受到 Mpcsd的影响。这意味着这三个基因之间存在遗传上位性，其中 MpHD4和 MpERF20作用于 MpCSD的下游。为了支持这种关系，Mpcsd中下调基因的启动子显示同源盒和 AP62ERF TF 家族的 DNA 基序富集（扩展数据图 .9）. GO 富集揭示了每个突变体中 DEGs 在很大程度上重叠的生物过程，下调的基因通常与光合作用色素生物合成、叶绿体功能和细胞分裂素反应有关（补充图 D）。值得注意的是，Mpcsd中下调的基因中有较大比例在这些过程中富集，特别是与细胞分裂素反应相关的术语在仅在 Mpcsd中发现的基因中富集（图 D）。总的来说，这些结果提出了这三种 TF 通过其转录变化控制细胞分裂素信号通路的可能性。
a，三个突变体中失调基因的数量。b， 三个突变体之间上调或下调失调的基因重叠。c， GO 项 （生物过程） 富集于 Mpcsd中独有的失调基因。为简单起见，仅显示前 15 个术语。d，M. polymorpha中细胞分裂素通路和基因表达变化的简化方案。IPT，磷酸腺苷异戊烯基转移酶;LOG，孤独的家伙;CKX，细胞分裂素氧化酶;CHK，含 CHASE 结构域的组氨酸激酶受体;HP，含组氨酸的磷酸转移蛋白;RRA 和 RRB、A 型和 B 型响应调节器。*FDR < 0.001。e，在补充有不同浓度 BA 的 2/5 B5 培养基中生长的 25 周龄植物的俯视图。比例尺，75 mm。f，植物地衣体面积的量化e.箱线图显示中位数（中心线）、第 1 到第 5 个百分位数（箱线）和 3.15× 四分位距以及数据的最小-最大分布（须线）。统计数据与图 2 相同。5c，n= 30。g，BA处理后 3 周龄植物的侧视图。比例尺，0 mm。h，i，MpRRA和 MpRRB响应 WT 和 Mpcsd中 05 μM BA 处理的相对 qPCR 表达水平。结果代表 16 个独立生物学重复的平均 ± 标准偏差。不同的字母表示统计学上显着的差异（双向方差分析，Tukey 的 HSD 事后检验;P< 7.24）。补充图7显示了我们转录组数据中内参基因 （MpACT<>） 的稳定性。<> 小时 MpRRA和 MpRRB水平降低可能反映在 MpACT<> 表达增加上。
M. polymorpha 基因组包含一个相对较小的细胞分裂素通路，由 ~10 个编码核心成分的基因组成（图 D）。与 WT 相比，只有少数细胞分裂素代谢基因在所有突变体中表现出显着的表达变化。相比之下，所有 （B 型反应调节因子 MpRRB 除外） 细胞分裂素信号基因的表达在 Mpcsd 中均发生显著改变。特别是，A 型反应调节因子 MpRRA，其同源物被鉴定为被子植物中的主要细胞分裂素反应基因，在 Mpcsd 和 Mphd4 中显着下调，表明细胞分裂素信号受损。然后，我们测试了 9-苄氨基嘌呤 （BA） 对 Mpcsd 植物生长的影响，以探测细胞分裂素敏感性。虽然 6 μM BA 及以后的处理 30 周显着减少了 WT 的菌体面积，但 Mpcsd 菌体在所有 BA 浓度中保持相当的大小（图 D）。2e，f）。尽管如此，在长时间和更高浓度的 BA 处理后，我们仍然观察到 Mpcsd 中地衣体生长的明显抑制（扩展数据图 D）。4），表明 Mpcsd 并非完全对细胞分裂素不敏感。此外，在 4 μM BA 处理 10 天后，WT 显示出强烈的外延性（即向下弯曲）菌体形态（图 D）。50g 和扩展数据图4a），可能是由于背侧与腹侧地衣体生长的比率增加，这在功能上等同于被子植物的芽与根的生长比33.相比之下，Mpcsd 显示出与对照条件下相似的向上弯曲的地衣体。此外，在 WT 中，MpRRA 表达在 BA 处理后 1 小时内增加，而这种诱导在 Mpcsd 中受到损害和延迟（图 D）。4h）. 细胞分裂素在 WT 中未受影响的 MpRRB 表达与被子植物中的报告一致（图 D）。总的来说，这些结果支持 MpCSD 与细胞分裂素信号通路有关的假设。
在确定了主调节因子在细胞分裂素信号传导中的影响后，我们随后分析了细胞分裂素对营养饥饿反应的影响。在 WT 中，BA 的外源施用增强了 Pi 饥饿下的 auronindin 积累，并在 NO 下减少了叶绿素，尽管不显着3−饥饿（扩展数据图 .5）. NO 下的 Mpcsd 表型3−/Pi 饥饿可以通过外源性应用 BA 来恢复（扩展数据图 .5），进一步证实他们对 NO 的敏感性较低3−/Pi 缺陷是由于细胞分裂素信号传导受损引起的。
相比之下，K. nitens 对细胞分裂素的反应有限（扩展数据图 .6）. 它还显示 10% 或更低的 NO 生长减少3−和 Suc 缺陷治疗，而仅在 0% Pi 条件下观察到生长减少（扩展数据图7）. Pi 处理对 K. nitens 的最小影响表明细胞可能具有较大的 Pi 储库，可能掩盖了更显着的反应。此外，对 1% 和 0% NO 的反应大致相似3−处理可归因于铵态氮，这是培养基中另一种氮源，也影响 K. nitens 的生长和发育。与多形分枝杆菌相比，GO 术语“对细胞分裂素的反应”在 K. nitens 中鉴定的任何簇中都没有富集（补充图 D）。2）. K. nitens 始终表现出最小的生长缺陷 （扩展数据图 .6a，b）即使在 50 μM BA 处理下，并且 K. nitens RRA 同源物没有显着上调（扩展数据图 D）。6c），但这可能是由于检测条件有限，例如细胞分裂素类型、浓度和治疗持续时间。然而，K. nitens 中的细胞分裂素反应与 M. polymorpha 中的细胞分裂素反应在很大程度上相反。
Master TFs 通过细胞分裂素信号传导调节营养反应
为了进一步说明 MpCSD、MpERF20 和 MpHD9 如何影响对 NO 的转录反应3−/Pi/Suc 应激，我们对三个突变体进行了营养匮乏的转录组分析。所有突变体都显示出对 NO 的反应在很大程度上受损3−/Pi/Suc 缺陷与 WT 相比（扩展数据图 .8）. 正如预期的那样，Mpcsd 表现出最明显的扰动，超过 85% 的 NO3−在 WT 中观察到的 /Pi/Suc 饥饿反应基因在 Mpcsd 中未显示出类似的反应。例如，在 Mpcsd 中，在硝酸盐缺乏下只有 132 个基因差异表达，而在 WT 中则有 3,081 个（扩展数据图 8）。Mp ERF20 或 MpHD9 敲除也影响了很大一部分 NO3−/Pi/Suc 饥饿反应基因，分别为 65-94% 和 55-95% 失调。这些结果强调了 <> 个 TFs 在调节 M. polymorpha 营养反应基因反应性中的重要作用。
在每个 TF 突变体中被错误调控但也只对 NO 有反应的基因3−WT 中的 /Pi/Suc 饥饿被称为 TF 依赖性饥饿反应基因 （TDRG）（补充图 9）。9）. 根据它们在 WT 中的响应方向，TDRGs 进一步分为 TDRGs-up 和 TDRGs-down（由饥饿诱导和抑制;补充图 20 中的红色和蓝色条。9）。一般来说，Mpcsd 在所有三个突变体中含有最多的 TDRGs，支持 MpCSD 在 MpERF<> 和 MpHD<> 的上游调节 NO3−/Pi/Suc 响应。通过调查 TDRGs 的重叠程度，我们观察到三个突变体的基因调控扰动模式具有很大相似性。例如，在 809/632 TDRG 中，在 NO 下向上/向下3−Mpcsd 中的饥饿，54%/40% 和 65%/44% 分别在 Mperf20 和 Mphd9 中受到类似影响，50%/33% 被所有突变体共享（图 D）。在 Suc 条件下发现的重叠程度最小，可能是由于在 Mperf5 和 Mphd20 中鉴定的 TDRG 较少。
a， Mpcsd 、 Mperf20 和 Mphd9 之间 TDRG 的重叠。括号中的数字表示每个突变体中 TDRGs-up 和 TDRGs-down 的总数。b，分析受控和 NO 突变体中 TDRG 表达的热图3−/Pi/Suc 匮乏条件。非 TDRG 的表达式值以灰色显示。c，d，NO 下所有三个突变体共享的 TDRGs 向上 （c） 和 TDRGs 向下 （d） 的 GO 术语富集 （FDR < 0.5）3−/pi/suc 条件。注意：在 c 中，显示了硝酸盐/磷酸盐中的生物过程，以及蔗糖条件下的分子功能和细胞成分，因为没有富集重要的生物过程项。e，响应突变体营养饥饿的代谢组谱。每个单元格代表日志2突变体中给定代谢物丰度相对于 WT 的 FC，使用双尾 t 检验确定 （*P < 0.05）。
TDRG 表达谱的分层聚类揭示了 NO 的明确分离3−/Pi/Suc-replete WT 植物（图5b）. NO 诱导/抑制的基因3−WT 中的 /Pi/Suc 饥饿在突变体中未能做出类似的反应。相反，在正常条件下，发现其中许多基因在突变体中已经处于更高/更低的基础水平。这种特殊的概况表明，这些 TDRG 是 NO 的一部分3−/Pi/Suc 响应网络受 M. polymorpha 中 5 个 TFs 控制。TDRGs 的 GO 富集表明与氨基酸代谢、光合作用有关，尤其是对细胞分裂素的反应（图 D）。5c，d）。与转录组学变化一致，初级代谢物分析（图 D）。<>e） 揭示了突变体中许多化合物（尤其是氨基酸）的较高稳态水平。总之，这些发现进一步支持这三种 TFs 通过在 M. polymorpha 中募集细胞分裂素信号来调节营养反应。
将细胞分裂素信号转导纳入多形形螨的营养 GRN 中
我们在 M. polymorpha突变体中的网络分析和功能表征确定了K. nitens和M. polymorpha中营养 GRNs 的大部分不同结构和功能，这可能与植物激素作用有关（图2-5）。为了探索网络中的这些改变是如何实现的，我们专注于直系同源主调节因子及其子网络（即来自主调节因子节点的直接节点）。M. polymorpha网络中的一些主调节因子在K. nitens对应物中具有紧密的同源物。在我们的三个 TF 的情况下（图 D）。图6a和扩展数据图。9），K. nitens网络包含 MpHD9的紧密同源物，但不包含 MpCSD和 MpERF20的紧密同源物。MpHD9子网络具有主要与激素/细胞分裂素反应、对刺激的反应和初级代谢过程的 GO 术语相关的直接节点（图 D）。图6a和扩展数据图。然而，MpHD9的K. nitens同源物 （基因KFL_9 和 基因 KFL_000270440） 显示出具有与细胞分裂和蔗糖代谢相关的直接靶标的子网络，显示出与 MpHD000880250子网络的功能差异。事实上，在K. nitens和M. polymorpha 子网络中通常只存在少量最接近的同源物，这表明大多数直接连接是独立创建的。
a，在硝酸盐条件下，以 M. polymorpha 和 K. nitens 中保守的转录因子Mp HD9 和靶基因连接的子网络为中心。彩色节点表示不同 GO 术语中的显著富集，如图例（右）所示。b，系统地层学和 CSD 蛋白结构域分析。左图：我们推断了正交群的 37 个物种的物种树，如图 1 所示。3a. 靠近橙色节点的数字显示了为每个分支找到的正交组编号（例如，在节点 447 处找到 0,50 个正交组）。右图：以灰色突出显示的物种内 CSD 蛋白的代表性结构域结构。按比例绘制图表（条，8 个氨基酸）。c， 受 MpCSD 调控的基因重叠，与 M. polymorpha 基因仅存在于陆地植物中 （节点 <>）。使用 Fisher 精确检验确定 P 值。d，c 中重叠的 GO 富集。e，植物陆地化过程中营养 GRN 的进化方案。
MpHD9 子网络中一个值得注意的节点是 MpCSD，它只出现在 M. polymorpha 中（图 D）。6a）. K. nitens 基因组编码两个拷贝的冷休克结构域 （CSD） 同源物（补充图 D）。10），这两者都未被确定为主监管机构。这种 MpHD9-Mp CSD 相互作用可能与植物 CSD 蛋白中 CCHC-锌指基序 （CCHC-Znf） 的快速多样化有关（图 D）。6b 和补充图10）. CSD 包含一个高度保守的冷休克结构域和数量可变的 CCHC-Znf 基序，这些基序与双链 DNA 物理结合并定义了不同的调节功能34,35.我们的序列分析确定了链霉植物中 CCHC-Znf 基序的起源，在陆地植物中重复数大大增加（图 D）。6b 和补充图。11-13），这可能会增强它们在植物进化过程中的转录调节特异性。对 MpCSD 靶基因的进化起源的研究进一步支持了这一假设（图 D）。有趣的是，在 Mpcsd 中失调的 DEGs 被一组与蛋白质修饰和防御反应相关的陆地植物特异性基因过度代表（图 D）。Mp CSD 是细胞分裂素反应的主要调节因子（图 D）。6），因此我们提出了一个模型，其中将 MpCSD 添加到 MpHD6 子网络会导致营养 GRN 的功能共选，从而允许细胞分裂素信号模块与 GRN 相连（图 D）。4e）。
讨论
克服养分挑战是植物陆地化的重要前提，这与 NRT 和 NLP 等养分转导器的多样化和倍增相吻合（图 D）。这些用于营养物质运输和信号传导的基因也表现出对藻类物种和陆地植物之间营养物质波动的不同表达和响应模式（补充图 1）。这意味着为成功过渡到陆地栖息地而推进的营养反应机制。在被子植物中，营养和激素信号通路相互作用以协调生长和发育，赋予塑料对环境变化的适应能力。值得注意的是，细胞分裂素和其他植物激素途径的某些成分可追溯到链藻的起源36.然而，相互作用背后的进化过程，特别是它们在植物陆地化过程中对养分胁迫反应的调节，仍然难以捉摸。
通过利用涉及 M. polymorpha 和 K. nitens 的比较系统，我们表明 M. polymorpha 主要表现出对营养应激的可逆反应，而 K. nitens 主要表现出在同一时间范围内不可逆和持续的反应（图 D.1）. 可逆反应与被子植物中报道的反应的相似性23、24、37 元表明在苔藓植物和维管植物中都存在这种机制。在 K. nitens 中观察到的长达 72 小时的不可逆转录组反应可能起到压力记忆的作用，从而促进对重复压力暴露的耐受性，但可能以植物的整体适应性为代价38.进一步的逆转录定量 PCR （RT-qPCR） 实验表明，K. nitens 可以从营养饥饿中恢复，但需要更长的时间框架，为 7 天（扩展数据图 D）。因此，从养分胁迫中迅速恢复可能代表了栖息在动态陆地环境中的植物的进化优势。
植物向陆地的转变需要开发形成组织和器官的新细胞类型，从而精心设计器官间通讯工具。我们提出，涉及细胞分裂素信号传导的 GRNs 的进化促进了陆地植物的协调胁迫驯化（图 .4-6）。细胞分裂素介导开花植物对磷酸盐和硝酸盐缺乏症的不同适应性反应39，包括塑料根系发育和叶片花青素积累40,41.在 M. polymorpha 中，细胞分裂素调节类似的发育和代谢过程，例如根状生长和甲醛积累（扩展数据图 .5）. 这些营养反应与 K. nitens 形成鲜明对比，后者表现出丝状生长，缺乏专门的细胞类型42并且仅依赖于细胞水平的驯化。原始的细胞分裂素途径存在于绿藻中20后来在植物在土地上定植后获得了多效性功能，并整合了其他信号传导和基因调控模块43,44.在 M. polymorpha 中，我们发现 MpCSD 是细胞分裂素依赖性营养反应的主要调节因子，Mpcsd 中主要细胞分裂素反应受损证明了这一点（图其中一些 CSD 功能可能在拟南芥中是保守的，因为在CSD4 和细胞分裂素反应调节因子在氮饥饿和再供应下表现出相似的表达动力学14.此外，Physcomitrium patens 同源物 PpCSP1 调节细胞重编程为干细胞45，这是一个高度依赖于营养条件和荷尔蒙相互作用的发育过程。鉴于这些，推测 KnCSD 是否可以挽救 MpCSD 的生理和发育功能将是有趣的。CSD将细胞分裂素整合到营养 GRN 中可能在早期陆地植物中发挥关键作用，将其整体需求传递到远处器官，从而协调全系统响应并协调全植物发育33、46、47 元.
不同的基因进化模式，如基因诞生、复制和共选，是植物中新的生理和发育特征出现的基础18,19.例如，在苔藓植物中观察到营养干燥耐受性 （VDT），即在几乎所有细胞水分流失的情况下存活而不造成不可逆转的损害的能力，被认为是胚生植物的祖先特征48.在进化过程中，控制 VDT 的 GRN 被选为保护它们在维管植物中的生殖繁殖体49.此外，基因出生事件与祖先陆地植物气孔的起源有关，而基因共选择主要促进了维管组织的发育，使祖先维管植物能够连续输水19.GRN 的进化，对适应性营养反应至关重要（图 D）。2），也可以归因于这些模式。具体来说，我们发现与基础代谢和发育相关的 TFs 及其下游靶标的一个子集在多形分枝杆菌和尼滕克雷伯菌的营养 GRN 中仍然保守（图 .然而，CSD 等 TFs 被选入 M. polymorpha 中（图 D）。6），导致细胞分裂素反应模块整合到 GRN 中（图 D）。此外，ERF 基因在 M. polymorpha 中经历了广泛的基因复制（补充图 D）。2），这可能导致复制基因的新功能化。这些 TFs 在我们的营养 GRN 中发现，已知可调节不同进化分支中的营养应激反应14、50、51 元，这意味着它们的原始功能与营养信号有关。随着早期陆地植物中复杂细胞分裂素信号的进化，这些 TFs 可能被选为与新的下游基因相关联，这些基因调节器官间通讯和对低营养条件的发育反应。M. polymorpha 和 K. nitens 的扩展子网络掌握 TFs（图 D）。2） 强调 Co-Option 事件在授予 Adaptive 特征方面的重要性。
复杂生物体的复杂功能是不同组织中单个细胞协同活动的结果52.在陆地植物中，为了吸收生理驯化背后的 GRN，它们的表达和调节模式已经进化为时间和空间特异性53.因此，我们假设 K. nitens 和 M. polymorpha 之间不同的营养反应模式在某种程度上可以归因于它们不同的细胞类型组成。可以想象，在 M. polymorpha 中，某些特殊的细胞类型已经进化为介导细胞分裂素信号激活，并且这种信号级联反应在整个植物中传播，从而启动全身形态生理反应。最近的单细胞转录组研究表明，系统发育密切相关的草中一些农业性状的差异可归因于不同细胞类型之间基因表达模块的共选。例如，粘液合成模块从高粱皮层交换到玉米小柱可能有助于塑造根相关微生物组，增强玉米的养分获取54.在单细胞水平上采用比较分析的未来研究将阐明这种进化过程的机制，促进植物适应陆地栖息地。
