发表期刊：Nature plants
影响因子：18
发表时间：2019.12
人类基因组的远距离顺式调控元件（Cis-regulatory elements, CREs）已经进行了广泛的研究，但是在植物中，对顺式调控元件的广泛性、序列、染色质特征、转录调控行为和作用机制的研究较少。在玉米中，农艺性状的数量性状位点（Quantitative trait loci, QTLs）已被定位到基因间区，这些区域可能是驯化位点，包含有顺式调控元件并且被精细定位到远端区域，调控着它们的靶基因。目前虽然取得了一定的进展，但是仍然缺乏全面的顺式调控元件的分子特征研究和它们与目标基因相互作用的机制研究。
目前的研究发现，活跃的CREs存在于染色质可及性区域（Accessible chromatin regions, ACRs），这些可及性区域一般与转录因子的结合有关，导致染色质可及性增加。可及性区域周围的核小体，通常会存在组蛋白修饰，或招募转录调控因子定位到可及性区域。这些可及性区域附近的组蛋白修饰为我们洞察ACRs的CRE调控机制提供了便利。在该研究中，作者结合了转座酶可及性染色质测序技术（ATAC-seq）和多种染色质分析技术（ChIP-seq、Hi-C、MethylC-seq等），证明玉米基因组中存在丰富的远距离CREs。
作者首先使用ATAC-seq对玉米B73幼苗叶片的染色质可及性进行了分析，发现了32111个ACRs，证明ACRs在玉米基因组中广泛存在。对ACRs和距离上最近基因的接近程度进行了分组（图1b），作者发现10433个（占比32.5%）远距离ACRs（distal ACRs, dACRs）距离最近基因超过2kb，其中4091个dACRs距离最近基因超过20kb（图1d）。先前通过遗传图谱研究推测的远距离CREs，例如控制tb1、ZmRap2.7 、BX1、ZmCCT9 的CREs，都在ATAC-seq数据中得到验证（图1a）。
图1 玉米基因组中的ACRs。
2 Gene-dACR可能含有顺式调控元件
实验数据表明，许多dACRs具有重要的作用，还可能富含CREs，具有如下特征：1）DNA序列多样性在dACRs上明显降低（图1i）；2）由全基因组关联分析的结果可以确定，dACRs区域内的序列变异更可能与表型变异（图1j）和基因表达变异（图1k）相关；3）dACRs侧翼区域的基因富含转录调节功能。
3 Gene-dACR区域上存在特定的染色质修饰标记，暗示具有其调控功能
为了确定玉米dACRs区域是否存在特定的染色质标记，作者分别使用亲和捕获甲基化DNA测序（MethylC-seq）和染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）绘制了玉米叶片中的DNA甲基化和组蛋白共价修饰图谱（H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3、H3K36me3、H3K9ac、H3K27ac、H3K56ac和组蛋白变异体H2A.Z）（图2a-g）。研究发现ACR区域一般表现较低的DNA甲基化水平，几乎所有ACR区域包含H2A.Z变体标记。
作者试图确定组织特异的dACR区域的可及性变化是否与局部的染色质修饰或附近基因的表达变化相关。比较了叶片和未成熟花序的ATAC-seq、ChIP-seq数据和基因表达谱，对来自两个组织相同位点的ChIP-seq信号进行评估（图2h-m）。在叶片中鉴定出的大多数dACRs区域在花序中具有相同的可及性和染色质修饰。然而，15-21%在叶片中存在的dACRs区域在花序中并不是可及性区域（图2k）。组织特异性dACRs区域在一个组织中如果不是可及性区域那么在该组织两侧的染色质中也没有组蛋白乙酰化修饰。这种关联暗示组蛋白乙酰化可能与染色质可及性有正相关关系。相反，染色质可及性和H3K27me3之间的关系不太明确。组织特异的dACRs区域还与附近基因呈现关联。叶片特异性dACRs区域最接近的基因在叶片和花序中的表达水平差异明显（图2l）。此外，叶片特异性dACRs区域更常位于差异表达基因的上游而非下游（图2m）。
图2 dACR的染色质特征及其侧翼基因的模式。
4 dACRs通过染色质环与其靶基因相互作用
为了确定dACRs是否通过染色质环的形成直接与靶基因相互作用，实验首先在玉米幼叶上进行了染色质构象捕捉技术（Hi-C）实验，结果显示跨越距离超过20kb的dACR-基因环在玉米基因组中是常见特征，这些环包括了靶基因tb1、ZmRap2.7和BX1与其被推测含有远距离CREs的遗传定位调控区域之间的相互作用（图3a）。
然后使用靶向与转录激活（H3K4me3）和沉默（H3K27me3）相关的组蛋白修饰的抗体进行了HiChIP检测。这些结果表明，在转录激活和抑制过程中，dACRs通过染色质环与其靶基因发生相互作用（图3）。
图3 Hi-C和HiChIP识别dACRs与基因相互作用。
5 染色质环接触强度表明CREs参与转录调节
QTLs位点上的基因在局部区域内形成了多个染色质环（图4a）。在这些基因中，强度最大的染色质环发生在遗传控制区域和目标基因之间。例如，将tb1连接到其上游65kb处的调控区域的染色质环比与连接tb1的其他环更强，即使这些环跨越的基因组距离较短（图4a）。同样，将eQTL连接到其预测的靶基因的染色质环比非eQTL环更强（图4b，c）。此外，强H3K4me3-HiChIP环优先连接H3Kac组（两侧存在强烈的H3K9/K27/K56乙酰化修饰，缺乏其他染色质共价修饰）dACR中高表达的基因，而对于dACR和通过较弱环连接的基因之间的关系则不明显（图4d）。这些结果表明，可以通过连接CREs与基因的染色质环的强度来预测它们的相互作用，并且远程调控相互作用可以根据环的强度、方向和相对于靶基因的位置进行预测（图4）。
图4 环强度可以确定特定CRE与基因的相互作用。
6 基因的dACRs显示出较高的转录增强子能力
为了获得关于dACRs转录调控能力的独立和实证证据，作者在玉米叶肉细胞的原生质体中进行了自主转录活动调控区域测序（STARR-seq），首先在包含tb1控制区的约150kb细菌人工染色体上进行STARR-seq，该控制区域在玉米原生质体中已被证明具有增强子功能，并可作为STARR-seq的阳性对照。结果表明STARR-seq分析足够灵敏，能够检测到先前验证过的玉米增强子（图5a、b）。
接着，为了能够量化所有ACRs的增强子活性，作者对玉米叶子ATAC-seq数据进行STARR-seq分析。结果表明，dACRs通常具有作为转录增强子的能力，并且与基因形成染色质环H3Kac组dACRs显示出最大的增强子能力。
图5 dACRs显示出较高的转录增强子能力。
文章总结
该研究证明了玉米基因组中存在丰富的远距离CREs，dACRs通过染色质环与其靶基因发生相互作用，dACRs中预测的CREs也显示了转录增强子的活性。这些结果为CREs远基因距离调控基因的表达提供了功能支持。
