经济作物如大豆的产量受到高盐等非生物胁迫的显著影响，限制了作物的生长发育。面对盐胁迫，植物会进行转录和代谢重编程，激活保护机制以恢复离子平衡。研究表明，植物初次接触盐分后，可以通过预处理提高对后续盐胁迫的耐受性，这一过程中涉及到表观遗传修饰的变化，尤其是DNA甲基化和组蛋白修饰。DNA甲基化作为一种在植物和动物中保守的表观遗传修饰，影响转录因子的结合亲和力和基因表达。盐胁迫能诱导DNA甲基化的动态变化，进而影响应激调节因子的基因表达。在大豆中，特定的DNA甲基化变化与盐胁迫下的基因表达调控相关，这些变化可能与植物的盐耐受性有关。因此，研究DNA甲基化在盐胁迫预处理中的作用对于提高作物的耐盐性具有重要意义。
2024年11月27日，香港中文大学林汉明教授团队在Plant, Cell & Environment上发表的研究论文“DNA Hypomethylation Is One of the Epigenetic Mechanisms Involved in Salt‐Stress Priming in Soybean Seedlings”中发现，经过轻微盐胁迫预处理后，大豆幼苗的DNA甲基化水平的变化与基因表达调控和盐耐受性的提高密切相关。此外，组蛋白修饰与DNA甲基化之间可能存在协调作用，共同影响植物对盐胁迫的响应。
轻微预处理胁迫（0.3% NaCl）后，大豆幼苗的耐盐性得到了提高。预处理后的幼苗在没有受到任何盐胁迫的情况下，与对照幼苗表现出相似的表型，并在0.9% NaCl的触发胁迫下比未预处理的幼苗生长得更好（图1A）。
DNA甲基化在盐胁迫响应中起着重要作用。通过对预处理（P）和未预处理（N）的大豆幼苗进行WGBS（图1B），发现预处理幼苗在所有三种甲基化背景（CG、CHG和CHH）中的DNA甲基化水平均显著低于未处理幼苗（图1C）。预处理诱导的低甲基化在转录区域外尤为明显（图1D）。
在差异甲基化区域（DMRs）中，低甲基化DMRs的数量远多于高甲基化DMRs。CG-DMRs主要位于基因区域附近，而CHG-和CHH-DMRs主要位于转座元件（TEs）周围。特别是在基因相关区域，CHH-低甲基化DMRs的比例（36%）高于CHH-高甲基化DMRs（16%），表明基因区域在盐胁迫预处理下可能更容易发生低甲基化。为了验证DNA甲基化分析的结果，研究选取了几个含有MSRE识别位点的低甲基化DMRs进行MSRE-qPCR分析，结果一致显示预处理幼苗中这些基因的甲基化水平降低。
DNA甲基转移酶和去甲基化酶负责维持植物的甲基化状态。尽管预处理和未预处理幼苗中的DNA甲基转移酶和去甲基化酶的表达水平没有显著差异，但在预处理幼苗中观察到总DNA甲基转移酶活性显著降低（图1E），这可能是导致预处理幼苗中DNA甲基化水平下降的原因之一。
图1. 盐胁迫预处理或非预处理大豆幼苗DNA甲基化谱特征
在预处理幼苗中，基因区域周围的DNA甲基化水平整体下降，这可能影响了相关基因的表达。研究定义在转录区域上游2kb至下游2kb区域内具有差异DNA甲基化的基因为DMR相关基因（DMGs），并研究了这些基因的表达是否因DNA甲基化的改变而变化。预处理幼苗中低甲基化DMGs（hypo-DMGs）的数量远多于高甲基化DMGs（hyper-DMGs），尤其是在CHH背景下（图2A）。研究将CG、CHG和CHH的低甲基化DMGs合并，共得到2995个低甲基化DMGs进行进一步分析。
预处理幼苗中基因表达的整体水平显著高于未预处理幼苗，表明低甲基化的基因区域可能更有利于活跃的转录（图2B）。在6天的预处理期后，研究鉴定出10个基因在预处理幼苗中既出现了低甲基化现象，也表现出上调的基因表达（图2C）。例如，编码蛋白磷酸酶2C（PP2C）的GmHAI3基因和编码肉桂酰辅酶A还原酶样蛋白的GmCCR1基因（图2D）。
利用之前发表的盐胁迫预处理的ChIP-seq数据，研究检查了三种组蛋白修饰（H3K4me2、H3K4me3和H3K9ac）在低甲基化DMGs中的水平。与它们在转录激活（H3K9ac和H3K4me3）或抑制（H3K4me2）中的作用一致，预处理幼苗中低甲基化DMGs的H3K4me3水平显著更高，H3K4me2水平显著更低，而在预处理和未预处理幼苗中H3K9ac水平没有显著差异（图3E）。此外，低甲基化DMGs与这三种组蛋白修饰的差异富集基因（DRGs）之间存在一些重叠，特别是与上调的H3K4me3-DRGs之间的重叠（图2F）。
图2. 大豆幼苗中预处理诱导的低甲基化相关基因表达水平和组蛋白修饰
据报道，轻度盐胁迫会导致大豆对随后触发的胁迫做出快速而强烈的反应。研究假设全局DNA低甲基化启动盐响应基因，以增强它们在遇到后续胁迫时的表达。通过对预处理和未预处理幼苗的DNA低甲基化和时间序列转录组数据进行整合分析，发现在触发胁迫后，PT相较于NT有5103个上调的DEGs，其中344个同时是hypo-DMGs，表明低甲基化可能已经启动了这些基因，以增强对触发胁迫的响应（图3A）。
大多数的重叠基因（即hypoDMG-upDEGs）在触发胁迫72h后上调，其中一半在24h表现出快速且强烈的响应（图3B）。根据KEGG富集的结果，hypoDMG-upDEGs富集“柠檬酸循环（TCA循环）”、“光合生物中的碳固定”和“碳代谢”等途径，与预处理幼苗中增强的光合作用性能一致。此外，GO富集分析显示“脱落酸（ABA）激活的信号传导途径”、“油菜素内酯生物合成过程”和“黄酮类化合物生物合成过程”等术语富集（图3C），这些基因涉及光合作用、金属离子转运和ABA激活的信号传导途径，这些都是维持植物在盐胁迫下正常性能的重要过程，可能是DNA低甲基化的目标。
图3. 预处理大豆幼苗中触发胁迫上调低甲基化相关基因
由于DNA低甲基化可以改变染色质环境，促进转录因子（TFs）与其靶基因的结合，研究进一步调查了在预处理幼苗中DMRs中是否富集了对增强盐胁迫耐受性重要的TFs的结合位点。从基序分析结果中，ABRE样基序在触发胁迫诱导的hypoDMG-upDEGs的DMRs中显著富集（图4A）。此外，通过TF富集分析，发现六个TF的假定靶标在hypoDMG-upDEGs中显著富集，并且这些TFs在预处理幼苗中的表达水平高于未预处理幼苗。
特别是，四个TF被预测为结合ABRE或G-box基序，与基序富集结果一致（图4B）。这些bZIP TFs的调控网络显示（图4C），GmbZIP78、GmAREB1和GmbHLH122在触发胁迫的早期阶段通常在预处理幼苗中上调，并很快下降，而GmPIF1和GmARF37在触发胁迫后长达72小时内在预处理幼苗中的表达显著上调。这些结果表明，含有ABRE/ABF和G-box基序的DMRs中的DNA低甲基化可能促进了bZIP和/或bHLH TFs与靶基因的结合，启动ABA响应基因，增强了大豆幼苗对盐胁迫的耐受性。
图4. 预处理大豆幼苗中DNA低甲基化促进的转录调节
为了证实DNA低甲基化对预处理效应的贡献，在盐预处理的同时，使用DNA甲基转移酶抑制剂5‐AzaC来触发大豆幼苗中的DNA低甲基化。在触发胁迫后的3天和6天，与未预处理的幼苗形成相比，未预处理但经5-AzaC处理的幼苗以及预处理的幼苗均未表现出盐敏感性。此外，预处理的幼苗和5-AzaC处理的未预处理幼苗在触发胁迫后的第3天的光合速率显著高于未预处理的幼苗（图5A）。这些数据支持5-AzaC处理增强了大豆幼苗的耐盐性。
研究还分析了几个hypoDMG-upDEGs的表达情况，包括Glyma.01G112700、Glyma.12G028300、Glyma.14G069300和Glyma.15G176000。发现在触发胁迫后72h，5-AzaC处理的未预处理幼苗中这些基因表达增强，与预处理幼苗中的水平相似（图5B）。
MSRE-qPCR被用来对四个选定基因的DNA甲基化状态进行了检查。5-AzaC处理的未预处理幼苗在Glyma.14G069300和Glyma.15G176000基因上表现出显著的DNA低甲基化，而在Glyma.01G112700基因上观察到轻微的DNA甲基化下降。这些结果表明，DNA低甲基化是预处理大豆幼苗对后续盐胁迫更有效的转录反应和更高耐受性的重要因素之一。
图5. DNA甲基转移酶抑制剂5-AzaC预处理大豆幼苗会增强耐盐性
总之，这篇论文揭示了盐胁迫预处理通过诱导全局DNA甲基化降低，特别是CHH上下文中的甲基化，增强大豆幼苗对后续盐胁迫的耐受性。DNA甲基化水平的降低与DNA甲基转移酶活性的减少有关，并且这种变化促进了与ABA信号通路相关的基因表达。使用DNA甲基转移酶抑制剂5-AzaC可以部分模拟盐胁迫预处理的效果，进一步支持了DNA甲基化在盐胁迫预处理中的重要性。
