PBJ | Tn1a启动子的自然变异调控水稻分蘖

背景

水稻（Oryza sativa L.）是一种主要的粮食作物，养活了世界上一半以上的人口。水稻分蘖数是构成理想株型的重要农艺性状，对粮食产量至关重要。因此，阐明水稻分蘖形成的遗传和分子基础，挖掘自然群体中的有利等位变异，对于提高水稻产量具有重要意义。

结果

为了鉴定调控水稻分蘖发育的基因，作者研究了377个水稻品种分蘖数动态变化的表型，并进行了全基因组关联分析（GWAS）。在插秧后30天、45天和抽穗期重复检测到1号染色体上的一个QTL位点qTn1.7(7.84-7.92 Mb)（Fig. 1a）。SNP Chr1_7844142（G到A）的变异与不同分蘖阶段的分蘖数量有关（Fig. 1b）。作者分析了QTL位点中的10个注释的候选基因（Fig. 1a），发现LOC_Os01g14050和LOC_Os01g14090在编码区存在非同义突变；LOC_Os01g14050和LOC_Os01g14100 在低分蘖品种（LT）中的表达显著高于高分蘖品种（HT），而其他候选基因没有显著差异（Fig. 1c）。这些结果表明LOC_Os01g14050可能是qTn1.7的候选基因，命名为Tn1a。

为了验证Tn1a在水稻分蘖中的功能，作者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在Nipponbare（Nip）遗传背景下构建了Tn1a突变体tn1a-1和tn1a-2。与Nip相比，tn1a-1和tn1a-2植株的分蘖数量显著增加（Fig. 1d,f），表明Tn1a负向调控分蘖数量。作者还在Nip 背景下构建了Tn1a过表达系（Tn1a-OE1和Tn1a-OE2）和Tn1a RNAi系（Tn1a-RNAi-1和Tn1a-RNAi-2）。阳性的转基因品系显示，过表达品系的分蘖数量显著减少，而RNAi品系的分蘖数量增加（Fig. 1e,f）。综上所述，这些结果表明Tn1a负向调控水稻分蘖。

鉴于Tn1a与分蘖发育之间的显著关联，作者对463个栽培品种和71个野生稻材料进行分析并验证其功能位点，鉴定出8个变异，包括7个SNPs（CDS 1个，启动子6个）和一个272 bp插入变异（在启动子起始密码子上游387 bp处）。接着作者对其进行单倍型分析，发现了11个单倍型（Hap1-Hap11），其中10个单倍型（Hap1-Hap3、Hap5-Hap11）存在于野生稻中（Fig. 2a）。在栽培稻的4种单倍型中，Hap2主要存在于粳稻亚群中，而Hap3主要存在于籼稻亚群中。作者比较了每个亚种中4种单倍型的分蘖数，发现籼稻亚群中Hap2和Hap4的分蘖数显著高于Hap1和Hap3，但Hap1和Hap3、Hap2和Hap4之间没有显著差异；而粳稻亚群中单倍型之间也没有明显差异（Fig. 2b）。作者比较了这4种单倍型中的8个序列变异，结合表型发现Tn1a启动子272 bp插入（+272 bp）的品种的分蘖数显著高于272 bp缺失（-272 bp）的品种（Fig. 2c）。根据这些结果，作者推断Tn1a启动子中的272 bp插入缺失可能赋予水稻分蘖差异的功能变异。

作者通过LUC（荧光素酶）表达和qPCR测定，比较了四种主要单倍型（Hap1-Hap4）的启动子活性，其中272bp插入（+272bp）显著降低了Tn1a的启动子活性（Fig. 2d）及基因表达水平（Fig. 2e）。这些结果表明，272 bp的插入可能抑制了Tn1a的表达，并最终参与水稻分蘖。

为了进一步阐明Tn1a的8种自然变体对水稻分蘖的影响，作者利用启动子和编码区均与日本晴（Nip）有差异的TSN（-272 bp）构建了互补载体ProTn1a^TSN::Tn1a^Nip、ProTn1a^Nip::Tn1a^TSN和ProTn1a^TSN::Tn1a^TSN。qPCR测定结果显示，携带TSN启动子的互补系中Tn1a的表达量高于携带Nip启动子的互补系（Fig. 2g）。此外，通过北京和海南的转基因品系的分蘖性能，发现携带TSN启动子的互补系中的分蘖数量显著低于Nip，而携带Nip启动子的互补系在分蘖数上无明显差异（Fig. 2h）。这些结果表明，Tn1a启动区的272 bp 插入抑制了基因Tn1a的表达并促进分蘖。

作者利用PlantPAN 3.0数据库进行序列分析，发现这272 bp的插入包含一个TCP识别序列（Fig. 3e），而TCP21和Tb2已知在水稻分蘖中起正调控作用。随后作者检测了Tn1a 在TCP21和Tb2基因的不同转基因株系的茎基部中的表达水平，结果显示Tb2和TCP21均通过结合识别序列负调控Tn1a的表达（Fig. 3a）。

接着，作者进行了不同启动子变异体的瞬时表达实验，发现 Tn1a^TSN的启动子活性高于其他启动子变体（Fig. 3c）。此外，TCP21和Tb2转录抑制proTn1a^Nip、proTn1a^TSN和proTn1a^TSN+272，proTn1a^TSN的转录活性显著高于proTn1a^Nip和proTn1a^TSN+272，即携带272 bp插入的植株具有较低的转录活性（Fig. 3d,e）。作者还利用来自272 bp中的30 bp序列进行 EMSA实验，其中将TCP识别位点作为探针（Fig. 3f），结果显示，重组MBP-TCP21和MBP-Tb2均能够与标记的探针结合，但不能与突变的探针结合（Fig. 3g）。基于这些结果，可以推断Tn1a启动子内272 bp插入的变异与TCP21和Tb2的差异结合和调控有关。

为了进一步阐明Tn1a在水稻分蘖中调节分蘖的分子功能，作者收集了不同分蘖发育阶段以及孕穗期的植物组织，用于Tn1a的组织表达分析。结果显示，在未分蘖阶段，Tn1a在叶片中大量表达；在分蘖阶段，根的表达量最高。与分蘖期相比，孕穗期的茎基部和分蘖处Tn1a的表达水平较高（Fig. 4a）。

氨基酸序列比对显示，Tn1a和多个包含C2结构域的蛋白之间存在高度的序列同源性。为了确认Tn1a的表达模式，作者构建了ProTn1a：：GUS转基因植物，发现Tn1a基因在分蘖芽和根部均具有很强的GUS活性（Fig. 4b-j）。作者还将35S：Tn1a-GFP载体转化到水稻原生质体和烟叶中，以验证Tn1a的亚细胞定位。结果表明，Tn1a蛋白被明确定位于质膜，编码区的非同义变体不会影响其蛋白质定位（Fig. 4k）。以上结果表明 Tn1a 编码一个膜定位的C2结构域蛋白。

为了探索Tn1a调节分蘖的潜在机制，作者利用Tn1a作为诱饵筛选了酵母双杂交（Y2H）文库，并鉴定出OsCCC1（阳离子-氯化物共转运蛋白1）是酵母中Tn1a的相互作用伴侣（Fig. 5a）。为了进一步证实其相互作用，作者对Tn1a-GFP和OsCCC1-Myc构建体共转化的水稻原生质体进行了免疫共沉淀（Co-IP）测定，还对水稻原生质体进行了双分子荧光互补（BiFC）测定，成功证明了Tn1a-GFP和OsCCC1-Myc 之间的相互作用（Fig. 5b,c）。作者还研究了Tn1a是否影响植物体内OsCCC1蛋白含量，发现在水稻原生质体中OsCCC1表达水平一致的情况下，tn1a-1中的OsCCC1蛋白含量显著高于Nip，而Tn1a-OE1中的OsCCC1蛋白含量显著降低（Fig. 5d,e）。这些结果表明，Tn1a在体外和体内都与OsCCC1相互作用，并可能影响OsCCC1蛋白水平。

鉴于OsCCC1是一种K⁺转运蛋白，并调节K⁺转运。作者观测了在1000、500、100和0 μm K+条件下，Nip和tn1a-1突变体的第二分蘖芽长和植株生长情况，发现K⁺缺乏对Nip和tn1a-1突变体的分蘖芽长均有抑制作用，且对Nip的抑制作用更强（Fig. 5f,g）。此外，在不同浓度的K⁺下，Tn1a-OE1品系的K⁺含量低于Nip，而tn1a-1品系高于野生型（Fig. 5h）。综上，Tn1a通过与OsCCC1相互作用改变细胞内K⁺含量并抑制分蘖芽长度。

为了进一步探索Tn1a的调控途径，作者通过从Nip和tn1a-1突变体的茎基部提取RNA进行了RNA测序（RNA-seq）分析，共获得了276个差异表达基因（DEGs），其中包括tn1a-1突变体中的145个上调基因和131个下调基因（Fig. 6a）。GO富集分析和KEGG分析显示与Tn1a相关的差异表达基因在多个关键生物过程和代谢途径中的显著富集（Fig. 6b,d）。随后，通过qPCR实验比较了15个与水稻分蘖相关基因的相对转录丰度，发现OsIAA1、OsACO5和OsPht1;4在tn1a-1突变体中表达增加，而其余基因的表达降低（Fig. 6c）。综上这些结果表明，Tn1a可以通过影响与植物激素、转运蛋白和转录因子相关的基因的表达水平来实现分蘖调节。

最后，为了测试Tn1a对细胞内K⁺含量的影响是否影响下游基因表达，作者在正常和K⁺缺乏条件下，检测了野生型和tn1a-1突变体的茎基部中上述基因的表达水平，发现Nip中SGL1、GID1L2、OsKS1、OsNPF2.2、OsPCF7、OsPIL13、OsHOX12和OsTB1的表达水平在K⁺缺乏条件下显著升高；而tn1a-1没有显著变化（Fig. 6e）。这些结果表明Tn1a参与K⁺对这些基因的调控。

为了分析栽培稻和野生稻中272 bp插入或缺失的进化关系，作者利用71个野生稻和287个栽培稻种质的组合构建了最小跨度树（Fig.7a）。结果表明，272 bp缺失起源于野生稻，主要存在于籼稻亚群体中。粳稻亚群中272 bp的插入可能是在后期驯化和改良过程中的基因突变引起的。

为了了解Tn1a的育种利用情况，作者研究了339个栽培稻品种的育种过程中等位基因频率的变化，发现272 bp缺失和插入分别主要存在于籼稻和粳稻亚群中，与地方品种或改良品种无关。此外，在育种和改良过程中，籼稻亚群中272 bp缺失的比例显著增加（Fig.7b）。由于Tn1a通过改变细胞内K⁺含量来调节水稻发育，且粳稻亚群主要种植在华北地区，籼稻亚群主要种植在南方，因此推测Tn1a在两个水稻亚群中的等位基因分布归因于其环境适应性，尤其是不同地理位置的土壤钾含量。

作者收集了全国土壤全钾（TK）含量的数据，将所有品种推回其原产地，并比较了不同地区Tn1a等位基因频率与土壤K⁺含量之间的关系（Fig.7c），发现在籼稻亚群中，华南地区Tn1a^{+272 bp}等位基因的比例（28%，12/43）显著高于华东地区（10%，3/31）和西南地区（6%，2/33），与土壤K⁺含量呈负相关，华南地区的土壤 K+含量显著低于其他两个地区。粳稻亚群也获得了类似的结果，华中地区Tn1a+^{272 bp}等位基因的比例（90%，9/10）高于东北地区（79%，15/19），但是其土壤K⁺含量低于东北地区。这些结果表明，Tn1a^+272bp等位基因可能有助于水稻品种对贫钾土壤的地理适应性。

接下来，在正常和缺钾条件下，作者分别检测了272 bp插入或缺失的籼稻品种中Tn1a、TCP21和Tb2的表达水平，发现K⁺-deficiency（-K+）诱导Tn1a在两种基因型中的表达，且Tn1a+272 bp的Tn1a表达量低于Tn1a^{−272 bp}（Fig.7d）。与Tn1a^{−272 bp}相比, Tn1a^{+272 bp}对K⁺-deficiency的响应显著减弱（P = 0.0048），因此有助于具有该等位基因的品种对钾利用效率的提高。总的来说，在驯化过程中，Tn1a^{+272 bp}可能在缺钾地区的水稻品种中被保存下来；而在育种利用过程中，其在栽培稻中的比例下降。

鉴于272 bp插入或缺失在Tn1a启动子中的作用与水稻的地理适应性有关，因此作者设计了该功能位点的分子标记。结果表明，具有272 bp片段的品种比没有片段的品种具有更多的分蘖和更高的K⁺含量。因此，272 bp插入或缺失可用于标记辅助选择育种，以实现高产量和K⁺效率。

总结

本研究鉴定了新的水稻分蘖数调控基因Tn1a，并解析了其优良等位变异Tn1a^{+272 bp}参与调控分蘖及土壤钾适应性的调控机理，这项发现不仅增进了对水稻分蘖特性遗传基础的理解，而且为利用分子标记辅助选择育种以提高水稻产量和适应性提供了新的策略，为水稻品种的遗传改良提供了优异的基因资源。