IVD前沿：纸基传感器在耐药菌种鉴定中的应用

图片来源：npj biosensing

抗菌素耐药性是指微生物在使用抗菌剂进行标准治疗后存活的能力。获得性耐药可以通过几种机制发生，包括水平基因转移过程改变了抗生素的靶点，减少药物摄取，或增加药物外排，导致耐药性。例如，金黄色葡萄球菌对青霉素和其他β-内酰胺产生耐药性，是由于产生了灭活酶β-内酰胺酶并介导了β-内酰胺的水解。

抗生素药敏实验（AST）的发展是为了应对日益严重的抗生素耐药性威胁。AST未来可整合测序和快速表型鉴定技术，从复杂样品中分离病原体的微流体技术以及多路分析，简化测试过程，从患者标本中直接分析。此外，POCT平台的发展可迅速准确地诊断感染，并监测不易获得治疗设施的疾病。

许多基于纸张的平台已经被开发出来用于病原菌的检测。基于纸张的传感器代表了一组有前途的POC诊断工具，因为它们提供了快速、经济、用户友好的方法，并且在某些情况下，无需设备即可识别细菌种类。由于纸张独特的形态和结构特性，它可以有效地支持各种分析方法，如比色法、荧光法和电化学检测等，并可提供更低的检出限，需要更小的样本量，并且能够缩短分析时间。下面详述了用于鉴定AMR细菌种类的各种纸质平台，重点关注整个细菌细胞、核酸和酶等靶点（如下图）。

AMR细菌种类鉴定的纸质传感器综述。

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响应与分析物的相互作用，比色传感器表现出可见的颜色变化。显色底物根据pH值、代谢和/或酶活性的变化或纳米颗粒与靶位点的相互作用而改变颜色。通过检测AMR物种中抗生素敏感性的靶向位点、代谢活性和灭活酶的变化，比色检测已经发展用于检测AMR细菌。

AMR细菌种类可能表现出改变的形态特征。基于全细胞的传感技术侧重于通过与细胞包膜内的特定靶标（如细胞表面蛋白和受体、肽聚糖、脂质和外多糖、细胞外DNA （eDNA）或酶）相互作用来鉴定AMR细菌。

观察抗生素存在下的细菌生长动态仍然是AST最直接的方法。纸质AST芯片等纸质平台允许实时观察细菌浓度的变化。显色底物可用来鉴定代谢活性细菌。代谢活跃或不受抗生素影响的细菌由于细菌酶介导的氧化还原反应而改变颜色。细菌纸AST芯片（Bac-PAC）的多路纸基微流控装置允许同时检测多种抗生素。与纸质AST芯片需要14-16小时相比，Bac-PAC在10小时内识别出细菌种类。这种改进的传感器在鉴定12种不同的AMR细菌种类时准确率达到90%，降低了成本和分析时间。表面蛋白也可以作为全细胞传感的靶标。识别元件，如抗体或适体，通常可集成在微流体系统中。三维（3D）纸张技术联合微流体系统，可以同时检测细菌并进行AST。

基于比色纸的抗菌素耐药性鉴定平台。

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抑制特定酶的活性是某些抗菌药物杀菌的有效策略。为了克服这些杀菌作用，细菌产生灭活酶灭活抗生素。基于纸张的微分析设备（µPADS），如纸盘，已经开发使用酶作为靶标用于AMR物种鉴定。细菌在休眠和活跃状态下会改变它们的酶水平，而细菌的休眠可以与抗生素耐药性直接相关。氧化还原酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和β-内酰胺酶等酶都可作为靶标。除了纸盘外，还开发了一种用于AMR细菌种类鉴定的纳米电动纸分析装置。在这个装置中，细菌细胞通过外部电压裂解，从而释放出β-内酰胺酶等酶。这些酶在纳米多孔膜中与显色剂发生反应。

因此，引起抗生素修饰的酶已被广泛研究用于AMR物种的鉴定。染色底物与酶的直接反应提供了物种的快速鉴定。考虑到资源有限的情况，带有预吸附显色底物的纸盘可以提供最先进的技术。

基于比色纸的抗菌素耐药性鉴定平台。

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基因突变和水平基因转移是通过改变靶点从而驱动耐药性出现和传播的关键。例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株表现出对β-内酰胺的高水平抗性，这是由于PBP2a的获得和表达。当评估与已知遗传标记相关的抗性时，基因型分析是AST最可靠的方法之一。

利用核酸鉴定抗菌素耐药性细菌的流行技术之一是环介导等温扩增（LAMP）。LAMP反应物含有DNA染色染料，有助于比色分析。像纳米银片这样的显色底物已被用于MRSA物种的视觉鉴定，它们表现出表面等离子体共振（SPR）而显色。该方法为MRSA物种的鉴定提供了快速（30分钟）和敏感（1个基因拷贝）的工具。LAMP中，新的DNA合成在溶液中释放质子，与经酚酞处理的圆盘相结合可用于高效的可视化。该技术已用于万古霉素耐药肠球菌中vanA和vanB基因的检测，可在45-70分钟内鉴定万古霉素耐药肠球菌，只需要低样品浓度（102 CFU/mL）。

荧光法具有更高的对比度，因此相对比比色法更敏感。LAMP也可以与荧光基团（SYBR Green I）相结合，使信号可视化。作为SYBR Green I的替代品，金属配合物探针也可用作光开关。金属配合物插入DNA后会产生高荧光，用于检测AMR细菌物种中存在的基因。Zhou等人开发了带有金属配合物的纸质芯片，用于同时检测多个AMR基因，包括mecA和ermC。这种方法提高了灵敏度，并使多重检测多种抗菌素耐药性成为可能，但需要较多的样本量和较长的鉴定时间（如下表）。

纸质LAMP装置的分析时间和LOD的比较。

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SERS是一种基于拉曼效应的光谱技术，能识别低浓度的分子。有一篇报道利用基于纸张的SERS来鉴定AMR细菌种类。将纳米银固定在纸上作为SERS底物（如下图）。生成了含有SERS标记的报告分子文库，以鉴定抗生素修饰酶。它们的相互作用产生条形码信号，从而能够检测到特定的分析物。因此，使用纸质SERS为AMR物种的鉴定提供了一种低成本、便携且易于使用的技术。

基于纸张的SERS传感器在AMR细菌种类检测中的示意图。

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由于其固有的光谱特性、功能化能力和易于封装的荧光探针，各种类型的纳米颗粒已被用作比色法、荧光法或SERS检测的受体。包括纳米颗粒在内的各种纳米系统已被开发用于AMR细菌种类的鉴定。例如，纸质创可贴已被开发为一种POCT，用于检测对药物敏感和耐药的大肠杆菌。细菌存在改变了创可贴的pH值，使溴百里酚蓝从绿色变成了黄色。药物失活酶β-内酰胺酶的释放，使创可贴颜色从绿色变为红色。该技术检出限低，为104 CFU/mL，分析时间2-4小时，特异性高。

在这篇综述中，作者重点介绍了用于AMR细菌种类检测的纸基平台。AMR物种鉴定的纸质传感器使用光学检测技术，如比色法、荧光法和表面增强拉曼光谱。与此同时，基于纸张的诊断方法在作为可靠的诊断工具引入临床实践之前面临着许多挑战。虽然基于抗体的传感器灵敏度通常相当高，但也意味着高生产成本和苛刻的处理要求。另外，虽然目测（特别是比色法）是最简单和最用户友好的，但它只能可靠地用于定性（或最多半定量）评估。除此之外，生产中的再现性和批对批一致性也可能成为潜在的挑战。

为了克服这些和其他障碍，将在将现有的手持技术（如智能手机）整合到量化过程中取得进一步进展。新的传感元件将继续开发，将提供卓越的灵敏度，而基于适体的传感器在这一领域具有重要的前景。此外，多路检测越来越受到关注，这将有助于提高未来纸质传感器的可靠性和功能。