神经母细胞瘤是儿童期颅外实体瘤中最常见的一种，多数患儿被诊断为复发/难治性(r/r)型NB，该类型预后差，目前仍然缺乏有效的治疗方案。当前靶向治疗的飞速发展为NB患儿的精准治疗提供了方向，能够帮助患儿提高生存质量、延长生存期。目前ALK蛋白被证明是神经母细胞瘤的重要的致癌驱动因子，因而ALK成为治疗神经母细胞瘤的潜在靶点。然而，由于固有和获得性耐药，ALK TKIs单药的治疗效果并不理想，因此，探索新型ALK TKIs的联合用药策略迫在眉睫。2024年4月，由 Suzanne D. Turner 和 G. A. Amos Burke 团队发表于Nature Communications 题为 Targeting NRAS via miR-1304-5p or farnesyltransferase inhibition confers sensitivity to ALK inhibitors in ALK-mutant neuroblastoma 的文章，通过全基因组CRISPR-Cas9敲除(GecKO)技术，筛选鉴定出异常表达ALK的NB细胞中调节ALK-TKI敏感性的主要基因和信号通路。研究结果显示，miR-1304-5p是一种NB肿瘤抑制因子和ALK-TKI敏感性的调节因子，能靶向抑制癌性NRAS诱导NB细胞发生细胞凋亡，该研究提出了基于miRNA或法尼基转移酶抑制剂（FTI）通过靶向NRAS以增敏ALK抑制剂的联合治疗策略，对改善ALK异常表达的(r/r)NB的预后具有重要意义。![]()
首先，作者对NB细胞进行了GeCKO的系列筛选，以探索表达抑制时使NB细胞对ALK TKIs发生耐受的基因，这些基因及其所在的信号通路可能在NB对ALK TKIs敏感性的调控中发挥肿瘤抑制因子的作用，从而提示了药物联合治疗的潜在靶点。研究团队筛选出4种miRNA (hsa-mir-136、hsa-mir-1304、hsa-mir-7975和hsa-mir-4746)进行了深入的研究。
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图1.在神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中进行GeCKO筛选并鉴定影响ALK TKIs敏感性的基因，该图（A）总结了敏感性靶基因筛选的质控流程图，（B）通过GeCKO筛选鉴定的miRNA基因的Venn图，抑制这些miRNA的表达可使SH-SY5Y细胞对布加替尼或塞瑞替尼抵抗，（C）布加替尼和塞瑞替尼筛选鉴定出的miRNA靶基因热图，以及（D-G）根据DMSO或ALK TKI处理后的gRNAs进行排名，展示布加替尼和塞瑞替尼治疗中常见的miRNA sgrna (has-miR-1304, has-miR-136, hsa-miR-7975, has-miR-4746)的变化。4种miRNA进行体外验证实验发现，只有抑制miR-1304-5p的表达能显著降低NB细胞系SH-SY5Y对ALK TKIs的敏感性。同时，将miR-1304-5p抑制剂转染到17种不同ALK、p53和MYCN状态的NB细胞系中，发现当miR-1304-5p被抑制时，16个细胞系的活力均显著增加，而miR-1304-5p模拟物转染后导致所有NB细胞系的细胞活力显著降低，以上结果证实miR-1304-5p是NB的广谱肿瘤抑制因子。![]()
图2.miR-1304能抑制多种NB细胞系的活力，降低ALK突变NB细胞对布加替尼和塞瑞替尼的敏感性。（A -D） SH-SY5Y细胞活力和ALK TKI ED50s，（E, F）在17个NB细胞系中转染miR-1304-5p抑制剂或miR-1305-5p模拟物72小时后的细胞活力。蓝色标注ALK WT细胞，其他细胞系有激活的ALK突变。进一步探索miR-1304-5p对NB抑制作用的分子机制，研究人员对转染了miR-1304-5p模拟物的SH-SY5Y和KELLY细胞进行了全基因组表达谱芯片分析，同时与miR-1304-5p的靶基因预测（ Target Scan）结果进行综合分析，根据实验结果进行RT-qPCR和Western blot验证，发现miR-1304-5p对RAS/MAPK信号通路中NRAS、RRAS、PTPN11和IQGAP1蛋白的表达的调控作用，其中NRAS表达水平在NB患者中与不良的临床预后显著相关，并且在耐药的原位NB异种移植模型中显著上调，而RRAS、IQGAP1和PTPN11的表达没有显著的预后价值。后续体外实验证明，敲低NRAS与转染miR-1304-5p模拟物均能使布加替尼和西瑞替尼在SH-SY5Y中的ED50显著降低，以上多种证据表明，NRAS是miR-1304-5p增敏ALK-TKI的重要作用靶点，因而，作者进一步研究了其作为ALK-TKI联合治疗靶点的潜力。![]()
图3.miR-1304-5p抑制NRAS表达。（A）筛选miR-1304-5p靶基因的实验流程图；（B）Hallmark_KRAS_signaling_up 富集分析（GSEA）；（C）用miR-1304-5p模拟物转染SH-SY5Y细胞 72 h后对目标蛋白进行Western blot分析；（D）使用miR-1304-5p模拟转染SH-SY5Y细胞后，由4个靶基因的3'UTR的双荧光素酶检测信号对照载体的比例定量分析柱状图；（E）SH-SY5Y细胞中4个靶基因±miR-1304-5p模拟物的细胞活力定量分析柱状图。![]()
图4.转染miR-1304-5p模拟物能增敏ALK TKIs。在mir -1394-5p模拟物转染和布加替尼(SH-SY5Y (A)和KELLY (C))或西瑞替尼(SH-SY5Y (B)和KELLY (D))联合治疗72小时后检测细胞活力和ED50。基于以上的实验结果，研究团队选择lonafarnib，一种能通过多靶点抑制RAS信号通路的口服FTI来进行后续的研究。实验结果提示，lonafarnib与ALK TKIs在在临床最大耐受剂量以内的较高浓度下出现显著的协同抑瘤作用，同时，协同作用与MYCN的扩增状态相关。![]()
图5.ALK抑制剂和FTI在ALK异常MYCN非扩增的NB细胞系中具有协同作用。（A-C）布加替尼、塞瑞替尼或洛那替尼治疗72小时后测定SH-SY5Y、KELLY和FELIX细胞系的细胞活力。lonafarnib + brigatinib或ceritinib在SH-SY5Y (D, E)和KELLY (F, G)中联合用药或单独用药72h的剂量-反应热图。synergy score>10表示具有协同作用。（H, I）在SH-SY5Y 和KELLY细胞中，使用lonafarnib和brigatinib或ceritinib联合或单药处理48小时测定caspase 3/7活性。接着，研究团队在3种具有ALK突变的高风险NB患者来源的异种移植模型中亦观察到显著的协同抑瘤作用。![]()
图6.ALK抑制剂和FTI在PDX细胞模型中协同诱导细胞凋亡。（A）lonafarnib和ceritinib单独或联合作用于FELIX PDX细胞72小时后的剂量-反应矩阵；（B）细胞凋亡caspase 3/7活性的定量分析柱状图；（C, E） lonafarnib和ceritini单独或联合作用于COG-N-557和COG-N-415 PDX细胞72 h后的剂量-反应矩阵。（D, F）使用lonafarnib和ceritinib或单一药物(相同剂量)联合处理72h后，COG-N-557和COG-N-415细胞凋亡caspase 3/7活性的定量分析柱状图。最后，作者在FELIX-PDX COG-N-426x模型中验证了lorlatinib和ALK抑制剂联用的疗效。体内实验观察到与对照组相比，ceritinib或lonafarnib单药治疗能使肿瘤生长速率降低，而联合用药治疗效果最为显著，在给药期间使肿瘤发生生长停滞，其抑瘤效率显著优于单药组，并延长了生存期，值得注意的是，在整个治疗期间并未观察到毒副反应，相似的结果在COG-N-415x PDX神经母细胞瘤模型中也得到了验证。因此，该研究在体内证实了ALK TKI和FTI联合用药在治疗ALK异常的高危NB异种移植模型中具有高疗效和良好的耐受性。![]()
图7.ALK抑制剂(ceritinib)与FTI (lonafarnib)的联合在体内显著抑制PDX肿瘤的生长。（A）皮下注射COG-N-426x原代NB细胞的NSG小鼠的肿瘤体积随时间变化的曲线图。(B)Kaplan-Meier EFS分析。(C)实验组小鼠在实验终点相对于基线体重的体重。(D) MRI扫描的代表性图像。红色箭头提示肿瘤；（E）免疫组织化学实验检测p-ERK在小鼠肿瘤组织中的表达。综上，该研究利用3种不同的ALK和MYCN状态的PDX模型验证了ALK TKI和lonafarnib的协同抑瘤效应。该联合用药组合的在体内的安全性良好。值得注意的是，即使在停止治疗后观察到肿瘤的复发，但治疗后观察到的缓解仍具有重要的临床意义，这项研究为治疗难治性/复发性神经母细胞瘤提供了一种新的策略，值得进一步深入探索。撰文
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排版 | Sheila 校对 | uu
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*本文由深圳市拾玉儿童公益基金会“儿童肿瘤前沿”团队编译或约稿，文中图表均源引自文献原文。本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。如需转载，请留言或联系shiyu@curekids.cn。本文旨在分享儿童肿瘤科研前沿成果，不是治疗方案推荐。如需获得疾病治疗方案指导，请前往正规医院就诊。
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Targeting Anaplastic lymphoma kinase (ALK) is a promising therapeutic strategy for aberrant ALK-expressing malignancies including neuroblastoma, but resistance to ALK tyrosine kinase inhibitors (ALK TKI) is a distinct possibility necessitating drug combination therapeutic approaches. Using high-throughput, genome-wide CRISPR-Cas9 knockout screens, we identify miR-1304-5p loss as a desensitizer to ALK TKIs in aberrant ALK-expressing neuroblastoma; inhibition of miR-1304-5p decreases, while mimics of this miRNA increase the sensitivity of neuroblastoma cells to ALK TKIs. We show that miR-1304-5p targets NRAS, decreasing cell viability via induction of apoptosis. It follows that the farnesyltransferase inhibitor (FTI) lonafarnib in addition to ALK TKIs act synergistically in neuroblastoma, inducing apoptosis in vitro. In particular, on combined treatment of neuroblastoma patient derived xenografts with an FTI and an ALK TKI complete regression of tumour growth is observed although tumours rapidly regrow on cessation of therapy. Overall, our data suggests that combined use of ALK TKIs and FTIs, constitutes a therapeutic approach to treat high risk neuroblastoma although prolonged therapy is likely required to prevent relapse.
DOI: 10.1038/s41467-024-47771-x
