近年来，CRISPR作为一种革命性的基因编辑技术，成为了国家自然科学基金的研究热点之一，获得了大量的资助项目。
CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术，即成簇规律间隔短回文重复序列技术，是一种革命性的基因编辑工具。这项技术是根据细菌的免疫机制发展而来的，用于识别和剪切外来的遗传物质，如病毒DNA。CRISPR与Cas（CRISPR-associated proteins）蛋白一起作用，形成了一套高效的基因编辑系统。
CRISPR技术的核心是一个由导向RNA（gRNA）和Cas蛋白组成的复合体。
导向RNA是一个设计来与目标DNA序列互补的小RNA分子，它的任务是将Cas蛋白引导至特定的DNA位置。
Cas蛋白，尤其是Cas9是最常用的一种，具有剪切DNA的能力。当Cas9蛋白被正确引导到目标DNA位置时，它会切断DNA双链，从而引发细胞的DNA修复机制。在这个过程中，科学家可以利用细胞的自然修复机制插入、删除或替换DNA序列，实现对基因的编辑。
例如，在遗传病研究中，通过CRISPR技术可以有针对性地修正或剔除导致疾病的基因突变。如用于治疗β-地中海贫血的研究，科学家们利用CRISPR技术直接在患者的干细胞中修正HBB基因突变，这些修正过的细胞可以重新植入患者体内，产生健康的红血细胞。
CRISPR与疾病发生发展的科研关联
CRISPR技术通过修改特定基因，可以帮助研究者理解某些基因在疾病中的作用，例如通过敲除或敲入特定的基因来观察它们对疾病状态的影响。这种方法对于揭示疾病的分子机制和发展潜在的治疗策略至关重要。
CRISPR受到关注的原因
高效与精确：CRISPR比其他基因编辑技术（如ZFN或TALEN）更为高效和精确，能够在细胞内快速定位并修改特定DNA序列，减少非目标效应。
广泛的应用潜力：CRISPR不仅限于人类遗传疾病的研究与治疗，还可以应用于农业（如培育抗病或高产作物）、生物制药（如开发新型治疗蛋白）等领域。
伦理与法律的挑战：CRISPR的潜力引发了广泛的伦理讨论，尤其是关于基因编辑技术的安全性、可行性以及其对未来世代可能产生的长期影响。
由于这些特点和潜力，CRISPR技术引起了科研界和公众的广泛关注，并被视为未来生物科学和医学领域的关键技术之一。
下面来看几篇高分文献的研究：
1. CRISPR Activation Reverses Haploinsufficiency and Functional Deficits Caused by TTN Truncation Variants
《Circulation》IF：37.8
背景：TTN截断变异（TTNtvs）是在患有扩张型心肌病的个体中识别出的最常见的遗传病变，这种疾病的发病率和死亡率都很高。TTNtvs降低了正常TTN（titin）蛋白的水平，产生了截断的蛋白，并损害了肌原纤维的内容和功能。由于TTN的巨大大小、特定TTNtvs的罕见性以及对TTNtv致病性的不完全了解，针对TTNtvs的治疗方法一直难以找到。
方法：我们采用CRISPR激活技术，使用dCas9-VPR对TTNtv的致病性进行功能性探索，并在携带与扩张型心肌病相关TTNtv的诱导多能干细胞模型制备的人类心肌细胞和三维心脏微组织中开发治疗方法。我们进行了针对TTN的导向RNA筛选和自定义TTN报告分析，使用琼脂糖凝胶电泳量化TTN蛋白水平和亚型，并进行RNA测序以识别TTN激活的分子后果。心肌细胞表观遗传分析也被用来指定DNA调控元件，以实现心肌细胞特异性TTN激活。
结果：通过单导向RNA靶向TTN启动子或通过三维染色质相互作用与TTN启动子空间接近的调控元素，CRISPR激活TTN拯救了由TTNtvs引起的TTN蛋白缺陷。尽管增加了截断的TTN蛋白，提高TTN蛋白水平仍然能够使肌原纤维内容和收缩功能正常化。除了TTN转录本外，CRISPR激活还增加了与肌原纤维组装和肌原纤维相关的转录本水平。
结论：TTN CRISPR激活拯救了TTNtv相关的功能性缺陷，尽管增加了截断TTN的水平，这提供了证据支持单倍体不足作为杂合性TTNtvs的相关遗传机制。CRISPR激活可以作为治疗大部分TTNtvs的疗法进行开发。
原文链接：（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38235591/）2024-04
2. Whole-genome CRISPR screening identifies molecular mechanisms of PD-L1 expression in adult T-cell leukemia/lymphoma
《Blood》IF：20.
摘要：成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL）是一种侵袭性T细胞恶性肿瘤，预后差，治疗选择有限。程序性细胞死亡配体1（PD-L1）在ATLL的病理生物学中起到了重要作用。然而，哪些分子控制PD-L1的表达以及是否可以通过遗传或药物干预来改变ATLL细胞中PD-L1的表达，目前仍然不清楚。为了理解ATLL细胞中PD-L1表达的调控机制，我们在本研究中进行了无偏向的全基因组聚类定期间隔短回文重复（CRISPR）筛选。在ATLL细胞中，我们发现与连接素相关的基因NEDD8、NAE1、UBA3和CUL3负向调控PD-L1的表达，而STAT3则正向调控。根据遗传学结果，我们验证了使用JAK1/2抑制剂ruxolitinib或连接素途径抑制剂pevonedistat分别能够降低或增加ATLL细胞中PD-L1的表达。值得注意的是，这些结果不受ATLL细胞是否具有PD-L1 3'结构变异的影响，这种遗传异常在某些原发性ATLL患者中促进了PD-L1的过表达。Pevonedistat单独对ATLL细胞具有细胞毒性，与每种单一疗法相比，pevonedistat提高了针对PD-L1的单克隆抗体avelumab和靶向PD-L1的嵌合抗原受体（CAR）T细胞体外的细胞毒效应。因此，我们的工作揭示了ATLL细胞中PD-L1表达的一部分复杂调控机制，并通过使用pevonedistat上调PD-L1在ATLL细胞中展示了针对PD-L1的免疫疗法的初步临床前体外效果。
原文链接：（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38142436/）2024-04
3. The CRISPR effector Cam1 mediates membrane depolarization for phage defence
《Nature》IF：64.8
摘要：原核生物的III型CRISPR-Cas系统通过CRISPR相关的Rossman褶皱（CARF）蛋白效应子提供对病毒和质粒的免疫保护。这些入侵者的转录物，如果其序列与CRISPR RNA引导序列互补，将导致环状寡腺苷酸二级信使的产生，这些信使绑定CARF结构域并触发效应域的活性。虽然大多数效应子会降解宿主和入侵者的核酸，但有些效应子预测含有无酶功能的跨膜螺旋。这些融合了CARF和跨膜螺旋的蛋白如何促进III型CRISPR-Cas免疫反应目前尚不清楚。在这里，我们研究环状寡腺苷酸激活的膜蛋白1（Cam1）在III型CRISPR免疫中的作用。结构和生化分析显示，Cam1二聚体的CARF结构域绑定环状四腺苷酸二级信使。在体内，Cam1定位于膜上，预测形成四聚体跨膜孔，并通过诱导膜去极化和生长停滞来提供抗病毒感染的防御。这些结果揭示了CRISPR免疫不总是通过降解核酸来实现，而是通过更广泛的细胞反应来介导。
原文链接：（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38200316/）2024-01
4. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing of KLKB1 for Hereditary Angioedema
《New England Journal of Medicine》IF：158.5
背景：遗传性血管性水肿是一种罕见的遗传性疾病，导致严重且不可预测的肿胀发作。NTLA-2002是一种基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-CRISPR相关蛋白9的体内基因编辑治疗方法。NTLA-2002的目标是编码激肽释放酶B1（KLKB1）的基因，目标是在单次剂量后终身控制血管性水肿发作。
方法：在一项结合1期和2期试验的NTLA-2002 1期剂量递增部分中，我们对患有遗传性血管性水肿的成年人，分别给予单剂量25毫克、50毫克或75毫克的NTLA-2002。主要终点是NTLA-2002治疗的安全性和副作用情况。次要和探索性终点包括药代动力学、药效学以及基于调查者确认的血管性水肿发作确定的临床疗效。
结果：三名患者接受了25毫克的NTLA-2002，四名接受了50毫克，三名接受了75毫克。在所有剂量水平上，最常见的不良事件是输液相关反应和疲劳。在给予NTLA-2002后未观察到剂量限制性毒性效应、严重不良事件、3级或更高级别的不良事件或临床重要的实验室发现。从基线到最后评估之间，观察到剂量依赖性的全血浆激肽释放酶蛋白水平降低，25毫克组平均百分比变化为-67%，50毫克组为-84%，75毫克组为-95%。从基线到第1周至第16周（主要观察期）之间，血管性水肿发作次数的平均百分比变化在25毫克组为-91%，50毫克组为-97%，75毫克组为-80%。在所有患者中，从基线到最新评估之间，血管性水肿发作次数的平均百分比变化为-95%。
结论：在这项小型研究中，单剂量的NTLA-2002导致全血浆激肽释放酶水平的强效、剂量依赖性和持久性降低，且未观察到严重不良事件。在探索性分析中，所有剂量水平均观察到血管性水肿发作次数的减少。
原文链接：（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38294975/）2024-02
5. Pooled CRISPR Screening Identifies P-Bodies as Repressors of Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition
《Cancer Research》IF：11.2
摘要：上皮-间充质转化（EMT）是一个基本的细胞过程，常常被癌细胞利用来促进肿瘤进展，特别是转移。EMT由一个复杂的分子网络在基因调控的不同层面上进行控制。除了转录调控外，转录后机制也可能在EMT中发挥作用。在这里，我们进行了一个涉及1,547种RNA结合蛋白的CRISPR筛选，分析了它们对结肠癌细胞运动能力的影响，并确定了多个P体（PB）核心组分作为癌细胞迁移的负调控因子。进一步实验表明，通过沉默DDX6或EDC4来耗尽PB，能够激活EMT的标志性特征，从而增强体外细胞迁移以及体内转移形成。整合性多组学分析揭示，PB能够抑制EMT驱动基因HMGA2的翻译，这有助于PB介导的EMT调控机制。这一机制在其他癌症类型中也是保守的。此外，内质网应激是诱导PB解体和HMGA2翻译去抑制的内在信号。综合来看，本研究确定了PB在癌症EMT调控中的功能。
原文链接：（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38190710/）2024-03
总而言之，CRISPR技术是当前生物医学研究领域中的一个革命性工具，其原理基于细菌和古细菌的免疫防御机制，能够精确地编辑和修正DNA序列。通过针对特定基因进行编辑，CRISPR不仅可以帮助科学家们理解基因在疾病中的作用，还可以开发出新的治疗方法。例如，通过CRISPR技术可以修正遗传性疾病的致病基因，或通过增强或抑制特定基因的表达来探索其在疾病进程中的功能。随着技术的进步和伦理法律问题的逐步解决，CRISPR有望成为推动生物科学和医学领域前进的关键技术之一。
CRISPR研究可以通过以下途径进一步深入
疾病模型建立和基因功能研究：通过敲除或敲入特定基因，利用CRISPR技术建立疾病模型，深入理解基因在疾病发生发展中的作用，这对于揭示疾病的分子机制和发展新的治疗策略至关重要。
基因治疗的开发和优化：如对遗传性疾病进行基因修复或对肿瘤细胞进行基因编辑，通过CRISPR技术实现病理状态的逆转，如遗传性血管性水肿的体内基因编辑研究展示了CRISPR在临床治疗中的潜力。
系统生物学和全基因组筛选：利用CRISPR进行全基因组筛选，识别影响特定细胞状态或疾病过程的关键基因和调控网络，如癌症的上皮-间充质转化研究中的筛选工作。
组合治疗策略的探索：结合CRISPR技术与药物治疗，探索新的治疗组合，例如通过基因编辑影响肿瘤细胞的药物敏感性，优化治疗效果。
综上所述，CRISPR技术未来的研究方向将是多元化的，包括但不限于基础生物学研究、疾病机理解析、治疗策略开发和伦理法律评估，这些都是推动该领域持续进步的关键因素。
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