今天推荐的文献解读是来自哈尔滨医科大学肿瘤医院胃肠肿瘤科发表在Cancer Lett (医学一区 肿瘤学 Q1 29/223；IF:9.756)的题为“Photodynamic therapy induces human esophageal carcinoma cell pyroptosis by targeting the PKM2/caspase-8/caspase-3/GSDME axis”，即光动力疗法通过靶向PKM2/caspase-8/caspase-3/GSDME轴诱导人食管鳞状细胞癌细胞焦亡。
细胞焦亡（Pyroptosis）是一种新型程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD），受到研究人员的广泛关注；细胞焦亡被证明广泛参与感染性疾病、肿瘤、神经系统和心血管系统相关疾病等病程的发生发展，并发挥重要作用，深入研究和认识细胞焦亡在相关疾病发生、发展和转归中的作用机制，可为临床防治提供新思路。细胞焦亡是一种炎症性细胞死亡，明显不同于凋亡、坏死和自噬等细胞死亡方式，细胞焦亡的主要执行者（或效应蛋白）是Gasdermin蛋白家族。细胞焦亡生化特征主要包括炎症小体形成，激活Caspase和Gasdermin及释放大量促炎症因子；主要通过炎症小体激活Caspase家族部分蛋白，使其切割、激活Gasdermin蛋白，活化的gasdermin蛋白转位至膜上，形成孔洞，细胞肿胀、质膜破裂，导致细胞焦亡。细胞焦亡途径包括经典通路与非经典通路。这篇文章是通过研究光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)诱导食管癌细胞发生焦亡的机制，首次揭示了一条在PDT下诱导食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell Carcinoma， ESCC）发生细胞焦亡的调控网络。
研究思路
1. GSDME（Gasdermin-E）在ESCC组织中高表达
作者首先在GEPIA database (http://gepia.cancer-pku.cn/) 评估了不同类型肿瘤中GSDME的DNA拷贝数，发现GSDME在食管癌组织中的转录表达水平显著高于正常组织；TCGA database分析表明，GSDME在ESCC中的拷贝数显著高于其他组织；ONCOMINE database (www.oncomine.org)分析亦表明，GSDME在人ESCC肿瘤中的表达水平显著高于毗邻正常组织。WB和PCR分析结果与以上分析一致。这表明，GSDME在ESCC组织中高表达。
图1 GSDME在食管癌组织中高表达
注：A. 不同类型癌症中GSDME的DNA拷贝数分析（GEPIA数据库）; B. ESCC中GSDME的DNA拷贝数分析（TCGA）; C. ESCC中GSDME的DNA拷贝数(Oncomine); D. ESCC患者正常及肿瘤组织中GSDME mRNA水平(RT-qPCR); E. ESCC患者正常和肿瘤组织中GSDME的表达（WB）。
2. PDT诱导ESCC细胞焦亡
作者利用Hoechst 33342/PI染色法在Eca109和Ec9706细胞上观察到PDT介导的细胞焦亡特征；进一步检测发现PDT组乳酸脱氢酶(LDH)释放量显著高于对照组；为验证炎症PDT在细胞焦亡中的作用，作者采用ELISA法定量检测TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和IFN-γ水平，发现这些促炎因子在PDT组显著升高，提示质膜破裂渗漏；而其他光敏剂（PDT1和PDT2）处理也升高了细胞LDH水平和N-GSDME表达水平，并出现细胞焦亡特征。这些数据说明，PDT诱导ESCC细胞焦亡。
图2 PDT诱导ESCC细胞焦亡
A~B. PDT处理Eca109、Ec9706细胞4h、12h、24h的图像
C~ G. ELISA法检测TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的释放水平
图3 PDT诱导食管鳞癌焦亡
A. PDT处理Eca109和Ec9706细胞的透射电镜图（白色箭头表示膜破裂）;
B. 碘化丙啶和Hoechst 33342染色法观察裂解死亡细胞（白色箭头表示从质膜中冒出的气泡）
3. PDT诱导活化的caspase-3切割GSDME（而非Gasdermin-D，GSDMD）引发细胞焦亡
作者在PDT处理的Eca109和Ec9706细胞中没有检测到N-GSDMD和裂解的Caspase-1，但却检测到N-GSDME和活化Caspase-3的表达以非时间依赖的方式增加（WB），沉默GSDME后caspase-3的激活不受影响，相差显微镜观察细胞焦亡现象被逆转，提示GSDME可能被caspase-3激活；CCK-8检测PDT处理的si-GSDME细胞存活水平与Vector细胞相近，但LDH和IL-1β水平轻微升高。这些结果说明，PDT诱导活化的caspase-3切割GSDME（而非Gasdermin-D，GSDMD）引发细胞焦亡。
图4 PDT处理下激活的caspase-3裂解GSDME（而非GSDMD）诱导细胞焦亡
A. WB检测GSDMD和caspase-1表达；B. WB分析GSDME和caspase-3表达;
C. PDT处理24h后的细胞焦亡特征；D. WB和qt-PCR检测NC和Si-GSDME细胞中GSDME表达;
E. WB检测GSDME和caspase-3的表达
图5 PDT处理下激活的caspase-3裂解GSDME（而非GSDMD）诱导细胞焦亡
A~B. 碘化丙啶和Hoechst 33342染色观察裂解死亡细胞；C. CCK-8细胞毒性试验;
D. LDH细胞毒性试验; E. ELISA法检测IL-1β
4. 阻断caspase-3和caspase-8活性可抑制PDT诱导的细胞焦亡
作者分析了GEPIA数据库中食管组织、食道癌组织和癌旁正常组织的表达，发现GSDME的mRNA水平与caspase-3和caspase-8的表达水平极显著相关，caspase-3与caspase-8的表达水平极显著相关。进一步用caspase-3与caspase-8特异性抑制物（Ac-DEVD-CHO和Z-IETD-FMK）处理Eca109和Eca-108细胞，发现PDT处理下，细胞焦亡率下降，细胞存活率提高（CCK-8），LDH、IL-1β和N-GSDME释放被抑制；此外，Ac-DEVD-CHO没有诱导caspase-8的激活，而Z-IETD-FMK则抑制了caspase-3的活化。这些结果说明，阻断caspase-3和caspase-8活性可抑制PDT诱导的细胞焦亡。
图6 抑制caspase-3和caspase-8活性抑制pdt诱导的焦亡
A~B.GEPIA数据库分析GSDME与caspase-3、GSDME与caspase-8、caspase-3、caspase-8 mRNA表达的相关性；B. CCK-8分析; C. LDH测定；D. 观察NC组和DEVD组的焦亡特征
图7 阻断caspase-3和caspase-8活性可抑制pdt诱导的焦亡
A~B. NC和IETD组的焦亡特征；B. ELISA法测定IL-1β释放量; C. WB 检测GSDME、caspase-3和caspase-8的表达水平
5. PDT通过下调PKM2诱导焦亡
作者经GEPIA 数据库分析，发现包括食管癌的大多类型癌症的PKM2的DNA拷贝数都较高；进一步通过ONCOMINE、TCGA、GEO分析，发现人ESCC的PKM2拷贝数极显著高于正常组织。对22个ESCC细胞系（GSE63941）分析发现，PKM2在ESCC中表达水平显著高于正常组织。此外，GEPIA数据库的一些样本分析显示，在ESCC中，PKM2的转录水平与caspase-3、caspase-8和GSDME极显著相关。细胞过表达PKM2(OE-PKM2)，细胞焦亡现象被逆转，细胞肿胀减少；CCK-8显示死亡细胞减少，LDH和IL-1β释放受到抑制，N-GSDME、活化caspase-3、caspase-8仅在OE-PKM2组被检测到。以上数据说明，PDT通过下调PKM2诱导焦亡。
图8 PDT通过下调PKM2诱导焦亡
A. GSDME和PKM2，caspase-3和PKM2, caspase-8和PKM2转录表达水平相关性分析；B.WB和qt-PCR分析PKM2在NC和OE-PKM2组的表达; C. 细胞焦亡特征；D. CCK8分析；E.LDH检测；F. ELISA检测IL-1β
图9 PDT通过下调PKM2诱导焦亡
A~B. 碘化丙啶和Hoechst 33342染色观察细胞裂解死亡；C.WB分析GSDME、caspase-8、caspase-3表达;
6. 2-DG联合PDT抑制PDT的焦亡
应用GSEA分析，作者发现在ESCC病人中GSDME转录表达水平与糖酵解途径之间存在相关性(GSE23400, n = 53)。因此，作者探索了2-DG联合PDT的抗肿瘤疗效。结果显示，2-DG/PDT联合处理后，细胞焦亡现象逆转，CCK-8检测细胞存活率略有下降；而LDH、IL-1β和N-GSDME的释放受抑制，WB显示2-DG和PDT联合处理比单独应用PDT对PKM2水平无明显影响。这些结果说明，2-DG联合PDT抑制PDT的焦亡。
图10 2-DG联合PDT抑制PDT的焦亡
A.PDT、2-DG和2-DG/PDT组细胞死亡过程图像；B.GSEA分析GSDME表达与糖酵解途径负相关; C. CCK-8分析；D. LDH检测；E. ELISA分析IL-1β释放；F. WB分析GSDME和PKM2表达
7. PDT通过靶向PKM2/GSDME轴诱导ESCC焦亡
为进一步研究体内水平细胞焦亡在PDT介导的肿瘤抑制中所起的作用，作者将Si-GSDME、OE-PKM2和NC细胞注入裸鼠皮下组织。3周后腹腔注射光敏剂，用适宜波长的可见光照射。异种移植肿瘤实验结束后(24 h后)采集肿瘤组织和血清。LDH和ELISA分析显示，PDT组LDH、IL-1β水平均高于对照组，而Si-GSDME、2-DG和OE-PKM2组中LDH和IL-1β的释放量低于PDT单独处理组。免疫组化分析显示，所有PDT处理组活化的 caspase-3水平升高，PKM2水平降低；但活化caspase-3表达水平在2-DG、Si-GSDME和OE-PKM2组低于PDT单独处理组。此外，2-DG/PDT联合治疗组的PKM2水平与PDT单独处理组相似。WB分析结果表明，与PDT单独处理组相比Si-GSDME、2-DG、OE-PKM2组的N-GSDME表达水平较低。这些数据表明， PDT通过靶向PKM2/GSDME轴诱导ESCC焦亡。
图11 7.动物模型实验显示PDT通过靶向PKM2/GSDME轴诱导ESCC焦亡
A.PDT处理小鼠模型构建；B.肿瘤采集；C. 免疫组化检测活化Caspase-3和PKM2蛋白表达 ；D. LDH检测；E. ELISA检测IL-1β; F. WB分析GSDME表达
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