国人佳作：广东医科大学团队通过综合生物信息学研究揭示CMTM6为宫颈癌潜在危险基因

宫颈癌（Cervical cancer，CC）发病率居妇科三大恶性肿瘤之首， 是导致女性癌症死亡的第四大原因。子宫切除术联合放化疗是早期CC广泛使用的治疗方法。然而，大多数CC的治疗方案导致预后不良，特别是在接受子宫切除术的患者中。目前CC的详细分子机制尚不清楚，但据近几年的研究表明， CMTM6增加了程序性细胞死亡1配体1蛋白（PD-L1）的表达，从而损害T细胞功能，此外，CMTM6也是三阴性乳腺癌的潜在治疗靶点。然而，CMTM6在宫颈癌中的功能还在发掘之中。CMTM6在宫颈癌中诱导上皮-间质转化（EMT）中的作用也尚未清楚。

2024年6月，广东医科大学附属肿瘤医院团队在Frontiers in Molecular Biosciences杂志上发表题为“CMTM6 as a candidate risk gene for cervical cancer:Comprehensive bioinformatics study”的文章。该研究发现，人宫颈癌组织中CMTM6的表达高于癌旁非癌组织。体外实验表明，CMTM6通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK） c-jun n-末端激酶(JNK)/p38信号通路，促进宫颈癌细胞的侵袭、迁移、增殖和上皮间质转化。最终确定了CMTM6是宫颈癌的潜在治疗靶点。https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2022.983410/full

子宫颈癌具有侵袭和转移的高倾向，预后差，且宫颈癌患者的5年生存率为30% - 60% 。通过单因素分析显示，病理学分期（p = 0.000426）、t_分期（p = 9.53e−05）、n_分期（p = 0.00637）、m_分期（p = 0.0225）和淋巴结受累（p = 1.39e−05）是CC患者的独立预后因素。相反，年龄、种族、肿瘤纯度和组织学分级并不是影响CC患者预后的独立因素（图1）。

图1  总生存率的单因素Cox比例风险回归分析。

研究者使用GEPIA数据库中的数据，包含306例宫颈鳞状细胞癌和宫颈内腺癌（CESC）组织和14例正常宫颈组织的表达数据。腺癌（CESC）组织和14个正常宫颈组织。GEPIA数据分析显示，与正常宫颈组织相比，CMTM6在CESC中过表达（箱形图，图2A， p < 0.05）。CMTM6低表达患者的生存率高于CMTM6高表达患者(p < 0.05， log rank检验；图2 b)。此外，研究者通过IHC证实了CMTM6在宫颈癌临床样本中的过表达（图2C）。

该结果表明，CMTM6的高表达在CC组织中比在邻近的正常组织中更为常见。早期诊断的CC患者预后较好，而转移性疾病患者预后较差。生存分析显示CMTM6低表达的CC患者生存期较长。因此，CMTM6的表达与CC患者的预后大致成反比。

图2  CMTM6在宫颈癌组织中的过表达预示着预后不良

研究者通过功能丧失和功能获得实验来研究CMTM6在CC细胞中的生物学功能。应用Western blot方法研究了CMTM6在人宫颈癌细胞系中的表达。如图3A所示，CMTM6在SiHa细胞中表达最深刻，而Hela细胞表达水平较低。接下来，为了研究CMTM6在CC转移中的功能作用，研究者使用慢病毒转导建立了CMTM6过表达或敲低的稳定细胞系（图3B， C）。

有趣的是，通过集落形成和CCK-8实验评估，CMTM6的沉默显著降低了CC细胞的增殖能力（图3E， G）。此外，根据transwell实验，CMTM6的沉默减少了CC细胞的迁移和侵袭（图3I， K）。

相反，在内源性CMTM6低表达的Hela细胞中，过表达CMTM6可显著提高其增殖能力（图3D， F）。Transwell实验显示，过表达CMTM6可增强Hela细胞的迁移和侵袭能力（图3H， J）。这些发现表明，CMTM6可增强CC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

图3 CMTM6促进宫颈癌体外增殖和转移

研究者研究了CMTM6在体内对肿瘤生长的影响；在注射后5周，与接受对照细胞的小鼠相比，CMTM6沉默组肺部转移病灶较少（图4A-D）。最后，对照组小鼠肺转移结节逐渐增大，而注射sh-CMTM6细胞的小鼠肺转移结节较少（图4E-H）。这些结果表明，敲除CMTM6可降低CC细胞在体内的转移潜能。

图4 CMTM6在体内促进CC细胞生长和转移

研究者使用KEGG数据库对共表达基因进行富集。结果表明CMTM6主要参与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路（图5A， B），这与Biological Process分析的结果一致。

上述细胞通路的富集表明CMTM6可以激活MAPK信号通路。转染sh-CMTM6后，采用Western blot方法检测mapk相关蛋白的表达水平。转染sh-CMTM6的细胞与转染sh-NC的细胞相比，磷酸化的p38、JNK和ERK(MAPK)水平显著降低（图5C）。

由前几个结果可知，CMTM6在CC组织中高表达。CMTM6的沉默抑制了ERK、JNK和p38的磷酸化，进而抑制了MAPK信号通路的激活。MAPK JNK/p38通路影响emt相关蛋白E-cadherin和vimentin的表达（Wang et al, 2017）。因此，研究者认为MAPK信号通路的ERK、JNK和p38在CMTM6诱导的CC转移中发挥了重要的信号作用。然而，需要进一步的研究来揭示潜在的分子机制。

图5  CMTM6激活MAPK信号调控EMT

既往研究表明，激活MAPK JNK/p38信号通路可诱导卵巢癌EMT 。结果表明，CMTM6的上调通过激活MAPK - JNK/p38信号通路诱导EMT。

研究者使用Western blotting来评估在过表达CMTM6的癌细胞中抑制MAPK通路是否可以抑制EMT。在用e- CMTM6和ERK/ MAPK抑制剂PD98059处理的细胞中，与用e- CMTM6 + DMSO处理的细胞相比，ERK磷酸化水平降低，而磷酸化的JNK和p38水平无显著差异。此外，用oeCMTM6和JNK/MAPK抑制剂SP600125处理细胞，导致磷酸化JNK水平降低，而磷酸化ERK和p38水平没有显著差异。用e- CMTM6和p38/MAPK抑制剂SB203580处理的细胞显示磷酸化p38水平显著降低；然而，磷酸化的ERK和JNK的水平没有明显变化（图6A， B）。Transwell试验用于评估CMTM6在CC迁移和侵袭中的作用。CMTM6过表达增强了Hela细胞的迁移和侵袭能力，而MAPK通路抑制剂则降低了细胞的迁移和侵袭能力(图6C， D）；统计数据如图6E、F所示。结果表明，CMTM6的上调通过激活MAPK - JNK/p38信号通路诱导EMT。

图6  抑制MAPK信号传导对cmtm6调控的细胞侵袭和迁移的影响

越来越多的证据表明，免疫细胞的浸润水平与肿瘤的进展密切相关。因此，研究者研究了CMTM6表达与CC组织中免疫细胞浸润的关系。图7显示了CMTM6基因在这六种免疫细胞免疫浸润水平上的拷贝数方差（CNV）分类。CMTM6表达与CD4+T细胞（p < 0.005）和巨噬细胞（p < 0.005）有显著相关性。

该结果表明，CMTM6与宫颈癌中CD4+的表达有关，可能是通过影响Th1/ Th2细胞因子水平，具体表现为通过干扰CMTM6的表达使Th1细胞增多，过表达CMTM6后使Th2细胞增多。CMTM6可能增加CD4+ T细胞并诱导Th2型免疫，相反，抑制Th1型免疫反应，将Th1/Th2的平衡转向Th2侧。具体而言，干扰CMTM6的表达可增强Th1型的分泌水平，过表达CMTM6可增强Th2型的分泌。

图7  CMTM6基因拷贝数变异（CNV）分类的6种免疫细胞的浸润水平

接下来，研究者探究了CC中潜在靶向CMTM6的miRNA使用了五个独立的在线工具（miTarBase、miRMap、TargetScan、miRDB和miRanda）来预测可能靶向CMTM6的mirna。选择四个数据库中有交集的miRNA作为候选基因，共鉴定出16个候选miRNA（图8A， Supplementary Material S1）。has-miR-545-5p、has-miR-514a-3p、has-miR-452-3p、has-miR-378a-3p和has-miR-548d-3p与CMTM6表达显著相关（图8B-F）。

LinkedOmics分析显示，CC中CMTM6过表达与其拷贝数像差呈正相关（r = 0.397, p < 0.001，图8G）， CMTM6过表达与CMTM6基因DNA甲基化水平呈负相关（R2 = 0.026, p < 0.001，图8H）。根据ENCODE数据库的ChIP-seq数据，TFs的结合预测了调节CMTM6的转录因子关系（Supplementary Material S2）

考虑到CMTM6在CC中的上调，研究者探讨了CMTM6在宫颈癌中的作用及其潜在机制。考虑到CMTM6可能通过调控miRNA促进宫颈癌的发展，研究者重点探索CMTM6的miRNA靶点。然而，目前还没有研究miRNA对CMTM6的调控作用。miRNA可能上调或下调CMTM6，影响宫颈癌的发生发展。

图8  CMTM6相关的上游机制