微生物所陈义华组/医科院药生所郭正彦组合作JACS：改造细胞色素P450酶选择性合成含不同类型吲哚骨架的环肽化合物

图1. cpOPMOs选择性合成含有2-吲哚酮或HO-HPI结构的环肽化合物

广泛分布于不同生物体中的含有2-吲哚酮或HO-HPI结构的生物碱表现出多种多样的生物活性，如抗细菌、抗真菌、抗肿瘤以及抗病毒等（图2A）。这些多样的结构和活性激发了研究人员对2-吲哚酮或HO-HPI结构形成酶的深入研究以及对高效生物催化剂的探索。目前，形成2-吲哚酮结构的酶主要包括黄素依赖的单加氧酶（FMO）、细胞色素P450单加氧酶以及特殊的双加氧酶，其中FMO的研究较为深入，基于晶体结构推测其可能通过环氧中间体形成2-吲哚酮结构。HO-HPI结构的形成主要依赖于FMO和P450酶，其中FMO的体外酶学已经被深入研究，但相关P450酶的体外研究尚未被报道。在课题组前期的研究工作中，已经成功鉴定了alboflavusin A₁ （AFN A₁）的生物合成基因簇，并通过体内实验初步推测P450酶基因afnD可能负责HO-HPI结构的形成（图2B；JACS 2018）。

图2. 含有2-吲哚酮或HO-HPI结构的代表性天然产物。（A）来自不同生物体的含2-吲哚酮或HO-HPI结构的生物碱；（B）含有HO-HPI结构的环六肽化合物。

AfnD及其同源蛋白可以催化形成HO-HPI和2-吲哚酮结构

为了验证AfnD的功能，作者以pre-AFN A₁（12）为底物，发现P450酶AfnD可以催化底物12生成两种产物（图3A），即含有HO-HPI结构的AFN A₁（9）和含有2-吲哚酮结构的AFN C₁（13）。并且还观察到反应过程中pH值会影响两种产物的比例。在pH 6.0下，反应倾向于生成产物13，在pH 8.0下，反应则倾向于生成产物9（图3B和图3C）。

通过生物信息学分析发现AfnD与其同源蛋白HmtT、ClpD、KtzM和LtzR的序列一致性高达60%左右。以12为底物进行测试时，发现HmtT、ClpD、KtzM和LtzR均可以将其转化为9和13，且其反应过程中pH值影响的规律与AfnD类似，暗示这5个P450酶可能具有相似的催化机制。

图3. cpOPMOs的酶学研究。（A）不同cpOPMOs与底物12的活性测试；（B）不同pH值下AfnD与底物12的活性测定；（C）AfnD催化底物12生成产物9和13的反应过程。

HmtT通过两个关键残基介导HO-HPI和2-吲哚酮结构的形成

为深入探究cpOPMOs的催化机制，作者基于HmtT的晶体结构，利用分子对接搭建了HmtT-pre-AFN A₁的复合物模型，发现底物12沿着通道进入了活性位点，且色氨酸残基靠近heme，暗示反应适合发生（图4A和图4B）。在P450酶的催化过程中，推测I螺旋上一个保守的苏氨酸残基可能负责氧的激活。为验证这一假设，作者构建突变株HmtT T236A，发现两种产物的产量显著降低（图4C）。因此，当底物12进入活性区域后，可能会在残基T236和潜在水分子的辅助下，形成具有催化活性的中间体Compound Ⅰ（Cpd Ⅰ）。

随后，Cpd Ⅰ与底物12结合形成Cpd Ⅱ和吲哚环氧中间体。模型分析发现，残基S75和D73分别位于吲哚基团的两侧，可能参与环氧打开以及两个产物的形成过程。接着，作者又构建突变株HmtT D73A和S75A，测试发现在中性条件（pH 7.0）下，HmtT D73A主要生成产物为9，而HmtT S75A主要生成产物为13。基于以上结果，作者推测可能的催化机制，首先在吲哚环氧中间体形成后，S75的羟基和D73的羧基可能会竞争结合吲哚环氧化物。然后，在路径1中，S75的羟基通过氢键网络与环氧化物结合，促进C8a侧C-O键断裂，再在水分子的辅助下形成含有HO-HPI结构的产物9。在路径2中，D73的羧基通过氢键与环氧化物结合，促进C3a侧C-O键断裂，再发生2,3-氢转移形成含有2-吲哚酮结构的产物13（图4D）。

图4. HmtT催化机制的推测。（A）HmtT与底物12的分子对接图；（B）HmtT与底物12的结合位点图；（C）HmtT及其突变体与底物12的比活力测定；（D）HmtT催化底物12生成产物9和13的机制推测。

5个cpOPMOs具有相似的催化机制

生物信息学分析显示，这5个cpOPMOs的3个关键残基（HmtT中对应的D73、S75和T236）具有较好的保守性。作者以HmtT为模板，使用AlphaFold2构建了AfnD、ClpD、KtzM和LtzR的结构模型。结构比对发现，这5个cpOPMOs的三维结构高度相似，均方根偏差（RMSD）小于1Å。蛋白AfnD、ClpD、KtzM和LtzR中I螺旋上保守的残基Thr与heme距离合适，推测其可能同样参与中间体Cpd Ⅰ的形成。接着将这4个P450酶分别与底物12进行分子对接，发现底物12均可以沿着通道进入活性位点，且两个保守的残基Asp和Ser（LtzR中为Thr）也分别位于吲哚基团的两侧，暗示它们可能与HmtT中的保守残基具有类似的功能（图5A）。

为研究AfnD的催化机制，作者构建了关键氨基酸残基突变株AfnD T237A、D74A以及S76A。酶活测定显示突变株AfnD T237A的催化效率显著下降，表明残基T237在AfnD的氧激活过程中起关键作用；突变株AfnD D74A主要生成产物9，而突变株AfnD S76A主要生成产物13，说明S76和D74可能分别负责HO-HPI和2-吲哚酮结构的形成（图5B），证实前文的推测。另外，作者还分别构建了ClpD、KtzM以及LtzR的D73A和S75A（LtzR为T75A）突变体，发现与之前的结果类似，3个D73A突变体主要生成产物9，而2个S75A以及LtzR T75A突变体主要生成产物13，暗示这5个cpOPMOs具有相似的催化机制。

图5. AfnD、ClpD、KtzM和LtzR关键残基的点突变研究。（A）AfnD、ClpD、KtzM和LtzR与底物12的结合位点图；（B）AfnD、ClpD、KtzM、LtzR及其突变体与底物12的比活力测定。

选择性合成含有HO-HPI或2-吲哚酮结构的环肽化合物

考虑到cpOPMOs的催化生成产物与反应过程中的pH值直接相关，作者以12为底物，测试了10个cpOPMO的突变体的最佳反应条件。发现5个cpOPMO的Asp突变体在中性条件（pH 7.0）下倾向生成含有HO-HPI结构的环肽化合物，5个cpOPMO的Ser/Thr突变体在酸性条件（pH 6.0）下倾向生成含有2-吲哚酮结构的环肽化合物。

随后，作者研究了所有cpOPMO突变体催化的底物不专一性。以环六肽16-22作为底物进行测试，发现cpOPMO突变体均能识别这些环六肽底物并生成两种不同的产物，表现出较好的底物不专一性（图6）。其中，cpOPMO的Asp突变体主要生成含有HO-HPI结构的环六肽化合物，而Ser/Thr突变体主要生成含有2-吲哚酮结构的环六肽化合物。值得注意的是，当底物结构与天然底物越接近时，相关的cpOPMO突变体催化活性越强。另外，还发现部分突变体能够催化环五肽底物生成两种产物。因此，这些cpOPMO突变体可以作为一套高效的酶学工具箱用于合成各种含HO-HPI或2-吲哚酮结构的环肽化合物库。

图6. cpOPMO突变体的底物不专一性测试