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研究背景
不同植物物种对干旱的适应能力各不相同，随着全球变暖，干旱已成为威胁世界粮食供应和生态系统多样性的主要非生物胁迫。本研究假设炎热、干燥的环境条件促进了野生谷物对干旱的适应优势的进化。为了验证这一点，研究了坡间适应性进化分化是否影响气孔和光合特性，以及基因组变异和转录组调控。本研究为小麦和大麦的育种开辟了新的前景，以应对未来变化的气候。
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研究方法
本研究共使用了在以色列卡梅尔山收集的51个基因型谷物(图1)。将这些野生谷物的种子在4°C潮湿发芽纸上春化1周，然后种植在含有泥炭和蛭石混合物的盆栽中，并添加缓释肥料。在初叶期，每盆中保留3株均匀、健康的幼苗。对于基因型(51)×处理(对照和干旱)的每个组合，使用3盆幼苗作为生物重复。所有植物在受控环境生长室内生长，温度为22 ± 2°C。分别在分蘖期、生长第4周、第4周和第3周进行干旱处理。通过停止灌溉使土壤持水量降低到10%，造成植株明显的萎蔫和卷曲。
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研究结果
3.1 干旱诱导了野生谷物不同的气孔和光合反应
利用荧光原位杂交分析，着丝粒和端粒特异性探针鉴定了AS和ES的短柄植物基因型。在干旱处理下，所有野生禾草种的净CO2同化率、气孔导度、蒸腾速率、干重和气孔宽度均显著降低(图2)。相反，这些野生牧草的内在水分利用效率显著提高。
3.2 干旱诱导调控气孔和昼夜节律的共享共表达基因模块
利用RNA测序技术鉴定了来自AS和ES的野生谷物的干旱诱导差异表达基因(DEGs)。主成分分析显示，草地物种间约63%的变异可以由前两个主成分解释(图3a)，并且在自发性禾草和短叶草中AS和ES基因型是分离的。
利用WGCNA对所有野生谷物基因型中高度相关的共表达基因模块以及MEs与生理性状之间的相关性进行了评估(图4)。模块-性状相关热图显示，AS和ES的RNA测序样本中分别聚集了10个和9个模块。还对异源四倍体B. hybridum及其二倍体祖先B. stacei进行加权相关网络分析，比较它们的转录格局。在短柄草共表达网络中发现了“高度连接”的中心基因(图5a)。京都基因百科和基因组中心基因的富集表明，“昼夜节律”是双歧杆菌转录调控的独特途径。这种“昼夜节律”途径的蛋白质相互作用网络表明，许多编码光感受器的基因，如Cryptochrome 1 (CRY1)和光敏色素A (PHYA)和光信号成分，如光敏色素相互作用因子1 (PIF1)、光敏色素相互作用因子3样5 (PIL5)和光敏色素1抑制因子(SPA1)，在B. hybridum中上调(图5c)，但在B. stacei中没有上调(图5d)。这些结果表明，干旱处理后，B. stacei的光周期途径没有被激活，可能延迟了从营养生长到生殖生长的转变。为了验证这一假设，在生长室和避雨棚的另外两个实验中记录了所有杂交花和B. stacei基因型的开花时间。试验表明，干旱处理后，B. stacei基因型的开花时间明显延迟(P = 0.0065)(图5b)。
3.3 野生谷物显示出独特的基因组特征和一致性
进行详细的单染色体分析，以检测INDELs、snp、选择性信号(FST、π、Tajima’s D)和XP-CLR在AS和ES基因型之间的分布。为了检测潜在的选择性扫描，我们研究了XP-CLR的分布，在Circos图中突出显示了前5%的XP-CLR(图6a)，πAS/πES峰显示了该物种核苷酸多样性最大的区域。与T. dicoccoides(上限5%，0.13)相比，FST在H. spontanum中明显显示出更大的范围，表明野生大麦中可能存在更大的种群多样性(图6a)。利用ANGSD计算了AS和ES种群中FST和Tajima’s D的分布。ANGSD得到的FST分布与VCFTOOLS计算得到的FST分布(图6)相当。与参考基因型的自发嗜血杆菌和双球菌相比，从AS收集的基因型比ES收集的基因型含有更多的snp(图6b)。
为了比较两种短茅属植物的干旱响应选择效应，我们评估了B. stacei和B. hybridum配对同源植物的πN:πS，它们是干旱与对照的DEGs(图6c)。在一个或两个短柄藓属植物中，共观察到130个πN大于πS的同源物，表明存在正选择和功能多样性。最重要的是，这些基因与气孔运动、ABA信号、免疫反应和植物与病原体的相互作用密切相关。参与气孔运动的基因在双歧杆菌中非常突出，而含有NB-ARC结构域的抗病基因在双歧杆菌中尤为明显(图6)。此外，除了中心点周围区域外，自发性双歧杆菌的假分子的同质性比双歧杆菌要高，这可能反映了该物种中异色着丝粒DNA的快速重排(图6)。
3.4 DEGs对大麦抗旱性的功能分析
首先测试了鉴定的斜坡特异性DEGs是否具有独特的核苷酸多态性和野生谷物耐旱性的功能(图7)。每个基因组重测序样本中每个斜坡特异性DEGs的突变信息分别显示在T. dicoccoides(图7a)和H. spontanum(图7b)队列中。NPQ4最常见的变异是AS基因型中的“内含子突变”和ES基因型中的“错义突变”。同样，在H. spontanum中，BRH1的突变类型在AS和ES群体中是不同的(图7b)。干旱触发的这三种斜坡特异性DEGs的调节在三种物种中是一致的(表1)。
然后，选择了这三个新基因，DRN1，NPQ4和BRH1，使用大麦条纹花叶病毒诱导的基因沉默(BSMVVIGS)在栽培大麦(Hordeum vulgare cv Golden Promise)(一种相关的驯化谷物品种)中进行功能验证（图8）。15天peg诱导的水分亏缺导致BSMV: hvdrn1接种植株的叶片萎蔫和生长抑制更为严重。
然而，与模拟接种植株相比，BSMV: HvNPQ4和BSMV: hvbrh1接种植株的这些表型显著改善(图8a)。沉默植株叶片中HvNPQ4、HvDRN1和HvBRH1的相对表达量与BSMV:Vector植株中的表达量相比显著降低。此外，在水分亏缺条件下，HvNPQ4和HvBRH1的相对表达被抑制，而HvDRN1的表达水平升高(图8b)。沉默HvNPQ4和HvBRH1导致接种植株的a、gs、DW和相对含水量显著增加(图8c-f)。相比之下，与模拟对照相比，沉默HvDRN1导致接种植株的gs、Tr显著增加，水分损失率更高，导致相对含水量和DW降低(图8)。总的来说，HvDRN1的破坏导致了水分亏缺敏感性，而沉默HvNPQ4和HvBRH1导致大麦植株的水分亏缺耐受性显著提高。这与这些转录本在不同草种对水分缺乏的反应中的差异表达一致。
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结论
本研究利用基因组学、转录组学、功能遗传学和生理学的综合方法，探讨了四种野生谷物在ECI中的干旱适应性。研究结果表明，在炎热和干旱地区，由于不同的基因组变异、转录组调控和由其独特栖息地形成的生理适应，自发稻和杂交稻的基因型进化出了更强的干旱适应能力。先进的测序技术和后基因组功能方法将允许以前所未有的规模研究应对非生物胁迫的分子机制。我们的研究结果将野生谷物的适应性进化差异和耐旱性遗传多样性联系起来，为探索和表征新基因和等位基因的功能开辟了新的可能性，从而培育出在温暖和干燥的全球气候下性能更好的谷物作物。
References：
Wang Y, Chen G, Zeng F, et al. Molecular evidence for adaptive evolution of drought tolerance in wild cereals[J]. New Phytol, 2023, 237: 497-514.
