TH360南北学院万里长征小组
成员：张志坚、张雅丽、谭登峰、张长征、王凤格、刘丙新、王红武、庞洁、张嘉楠、李晨、辛广军、赵海铭、董昕等老师。
2023年，农业农村部发布了《农业用基因编辑植物评审细则（试行）》（以下简称《评审细则》），给行业内的农业用基因编辑植物开展安全性评价并最终获得安全证书提供了法规指导。在过去的两年多时间内，莱肯生物作为生物育种CRO企业，在基因编辑生物安全方面也遇到了很多新的挑战，并积累了一些新的经验。今天借此机会分享给大家。
1、安全评价的内容
《评审细则》中明确了农业用基因编辑植物需要开展的评价内容，为方便大家查看，我们把相关内容进行了梳理总结（图1）。由于不同的性状需要开展的评价内容可能不一样，所以具体什么性状需要开展哪些内容可以查看《评审细则》中的具体要求。不过很多项目做下来后，我们觉得大家在创制基因编辑植物材料时还是需要结合安全评价的内容去制定有针对性的研发策略。例如：
（1）在选择编辑性状时要考虑评价的难易度。抗病、品质、生育期，这三者均是常见的能够通过基因编辑改良的性状，然而评价起来，难以程度差别很大，抗病最难、生育期最简单。
（2）在选择靶基因时要考虑分子检测的难易度。靶基因编辑情况是整个安全评价中最基础的内容，然而有些多拷贝的靶基因或与其他基因同源性很高的靶基因在做编辑情况评价时很难进行特异性的检测，从而导致不能给出清晰的编辑情况描述。
（3）在筛选编辑材料时要注意优选编辑基因型并尽早检测载体序列残留。由于编辑基因型会直接影响编辑后新蛋白产生的相关评价，因此需要优选不产生新蛋白或产生无安全性隐患的新蛋白的编辑基因型。另外，遗传转化过程中造成的载体序列残留是十分普遍的现象，且有很大的可能是不完整的载体片段，因此需要尽早检测编辑植物中的载体序列残留情况，以便更早地采取措施（例如育种手段分离掉或挑选无残留的材料）。
图1 农业用基因编辑植物安全评价内容
2、安全评价的难点
现行的农业用基因编辑植物的安全评价法规已经大幅降低了评价周期、评价难度和评价成本。然而在实际开展安全评价时依然会碰到一些难题和挑战，我们觉得编辑材料的特异性检测方法以及新表达蛋白的安全性部分是较为共性的难点，在有些项目中，这两个难点会变得非常突出。例如：
（1）编辑形式的多样性使得原有的转基因材料定性和定量PCR检测方法不能广泛适用，目前普遍采用编辑材料的检测方法包括PCR、KASP以及酶切连接等，但每种方法都有一定的局限性。另外，编辑后位点的特殊性也造成了开发对应的具有高度特异性和灵敏度且经济高效的检测方法变得有一定难度的。
（2）如果使用编辑手段敲除靶基因，可能会获得氨基酸序列很短的新蛋白，如果不能通过预测分析充分证明其安全性，则需要开展新蛋白安全性的实验，而一旦开展实验就会因为蛋白分子量太小碰到一系列挑战，如难以大量制备以开展急性毒性实验、检测稳定性时不好在PAGE胶中跑出条带等。
莱肯生物PD006项目编辑后新蛋白只有不到5 kD，常规SDS-PAGE胶根本无法跑出目标蛋白条带，通过优化SDS-PAGE胶配方才最终跑出目标条带。
（3）新蛋白表达量检测时无法获得有效的数值。这主要是由于在抗体制备过程中没有获得针对植物天然蛋白的特异性抗体。我们也发现有很大比例的细胞株是能够识别免疫原蛋白但是无法识别植物材料中的目标蛋白的，所以我们会在细胞株筛选的早期就引入植物源蛋白的检测指标以辅助细胞株的筛选，从而获得效果更好的抗体。如果植物材料中的目标蛋白丰度太低，还需要进行一些富集纯化的工作。
莱肯生物B76项目在获得新蛋白抗体细胞株后，对编辑材料的蛋白ELISA定量检测时得到的结果信号时极低，后来发现该抗体细胞株能够识别免疫原但是却不能识别植物材料中的蛋白。后来通过使用富集纯化后植物蛋白对候选细胞株进一步进行筛选，得到另外一个能够识别植物蛋白的细胞株，使用该细胞株进行了ELISA检测信号时是符合预期的。2024年10月28日
