DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
（1）DNA片段的扩增：PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
（2）琼脂糖凝胶电泳：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
2.方法步骤
（1）移液：用微量移液器按照配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。
（2）离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在管的底部。
（3）反应：将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。
（4）根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。
（5）将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。
（6）接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
（7）电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
3.操作提示
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
（2）缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
（3）在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
（4）在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
4.结果分析与评价
（1）可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。（P85“问题1”）
（2）如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。（P85“问题2”）
第3节 基因工程的应用
一、基因工程在农牧业方面的应用
基因工程在农牧业方面的应用主要被广泛用于改良动植物品种、提高作物和畜产品的产量等方面。具体来说，其在植物方面应用主要有培育转基因抗虫植物、转基因抗病植物、转基因抗除草剂植物以及改良植物的品质，在动物方面的应用主要有提高动物的生长速率、改善畜产品的品质。
1.转基因抗虫植物
(1)方法：从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将它导入作物中培育出具有抗虫性的作物。
(2)成果：已问世的转基因抗虫棉花、玉米、大豆、水稻和马铃薯等。
2．转基因抗病植物
(1)背景：许多栽培作物由于自身缺少抗病基因，因此用常规育种的方法很难培育出抗病的新品种。
(2)方法：科学家将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物中，培育出了转基因抗病植物。
(3)成果：转基因抗病毒甜椒、番木瓜和烟草等。
3．转基因抗除草剂植物
(1)背景：杂草常常危害农业生产，而大多数除草剂不仅能杀死田间杂草，还会损伤作物，导致作物减产。
(2)方法：将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可以培育出抗除草剂的作物品种。
(3)优点：在喷洒除草剂时，田间杂草会被杀死而作物不会受到损伤。
(4)成果：转基因抗除草剂玉米、大豆、油菜和甜菜等。
4.改良植物的品质：利用转基因技术可以提高植物的营养价值、观赏价值等。例如，将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高这种氨基酸的含量。我国科学家成功地将与植物花青素代谢相关的基因导入矮牵牛中，使它呈现出自然界没有的颜色变异，大大提高了它的观赏价值。
5.提高动物的生长速率：
（1）原理及方法：由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长得更快，因此科学家将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。
（2）成果：我国科学家将外源生长激素基因导入鲤鱼,在同等养殖条件下，转基因鲤鱼的生长速率比非转基因鲤鱼提高了42%〜115%。
6．改善畜产品的品质：有些人由于乳糖酶分泌少,不能完全消化牛奶中的乳糖，食用牛奶后会出现腹泻等不适症状，这称为乳糖不耐受。我国约有1/3的成年人对乳糖不耐受。为了解决这一问题，科学家将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低，而其他营养成分不受影响。
思考：从环境保护角度出发，转基因抗虫水稻与普通水稻相比在害虫防治方面的优越性有：减少了化学农药的使用量，降低了环境污染；降低生产成本。
二、基因工程在医药卫生领域的应用
（1）对微生物或动植物的细胞进行基因改造，使它们能够生产药物。这些药物包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等，它们可以用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、传染病、糖尿病和类风湿关节炎等。我国生产的重组人干扰素、血小板生成素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子等基因工程药物均已投放市场。
（2）利用基因工程技术，让哺乳动物批量生产药物。科学家将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由这个受精卵发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物,这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。目前，科学家已经在牛、山羊等动物乳腺生物反应器中，获得了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和a-抗胰蛋白酶等重要的医药产品。构建乳腺生物反应器的过程为：将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，由此发育成的转基因动物在进入泌乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药物,这称为乳腺生物反应器或乳房生物反应器。
（3）基因工程技术还可能使建立移植器官工厂的设想成为现实。目前，科学家正尝试利用基因工程技术对猪的器官进行改造，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。
三、基因工程在食品工业方面的应用
（1）利用基因工程菌生产食品工业用氨基酸。例如，阿斯巴甜是一种普遍使用的甜味剂，主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸就可以通过基因工程实现大规模生产。
（2）利用基因工程菌生产食品工业用酶。例如，奶酪是一种被广泛食用的发酵奶制品。大多数奶酪的生产需要使用凝乳酶来凝聚固化奶中的蛋白质。科学家将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶。另外，加工转化糖浆需要的淀粉酶，加工烘烤食品要用到的脂肪酶等也都可以通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产。
（3）利用基因工程菌生产食品工业用维生素。
思考：相比从天然产物中提取的酶，通过构建基因工程菌，然后用发酵技术大量生产的食品工业用酶的优点是：纯度更高，生产成本显著降低,生产效率较高。
四、其他方面的应用：基因工程使人们更容易培育出具有优良性状的动植物品种，获得很多过去难以得到的生物制品，甚至还能培育出可以降解多种污染物的“超级细菌”来处理环境污染,
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