新型抗OX40抗体Ab18的Fc段改造与鉴定

目的   对抗肿瘤坏死因子受体超家族成员4（OX40）单克隆抗体Ab18进行结构优化和生物学活性初步鉴定。

方法   采用ELISA检测Ab18与不同物种OX40的种属交叉结合活性。用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测Ab18与HEK293-hOX40细胞的结合活性。采用报告基因法检测Ab18的阻断活性和激动活性。采用点突变技术对Ab18抗体Fc段进行工程化改造，改变Fc段与Fc受体的亲和力。用ELISA和FCM检测其与人Fcγ受体ⅡB和人新生儿Fc受体的结合活性，用报告基因法检测改造后的Ab18及其突变体抗体的激动活性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）活性。

结果   Ab18抗体具有与小鼠、大鼠和恒河猴的种属交叉结合活性，相比对照抗体GBR830和KHK4083，Ab18与HEK293-hOX40的结合活性和阻断活性更强，Ab18与HEK293-hOX40的结合活性半数效应浓度（median effect concentration，EC₅₀）值为366.9 ng/ml，阻断活性半数抑制浓度为657.3 ng/ml。此外，Ab18、GBR830和KHK4083均具有激动活性。Ab18的ADCC活性EC₅₀值为25.7 ng/ml，激动活性EC₅₀值为14.9 ng/ml。Ab18经Fc段改造后，激动活性降低、与人新生儿Fc受体的结合活性增强、ADCC活性保持，具有较好的生物学活性。

结论   成功优化了Ab18，优化后的抗体具有更好的生物学活性。

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）作为复杂的皮肤疾病，其治疗存在巨大的挑战。传统治疗方法虽然可以有效治疗大部分患者，但是对于需要系统性免疫治疗的中重度AD患者可能会导致显著的长期毒性。新兴的针对特定靶标的药物通过阻断特异性细胞因子或细胞因子受体，在AD患者临床治疗上展现了显著效果。

TNF受体超家族成员4（OX40）在AD的发病机制中起着重要作用，AD患者体内OX40⁺ T细胞会释放大量细胞因子进一步促进炎症。抗OX40抗体已成为创新的治疗方法，在治疗中重度AD中受到广泛关注。靶向OX40抗体主要通过2种机制治疗AD，一是通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）杀伤OX40⁺ T细胞，另一是通过拮抗作用阻断OX40配体（OX40 ligand，OX40L）对OX40⁺ T细胞的激活，从而抑制T细胞的增殖。研究表明，部分抗OX40抗体可结合B细胞、树突状细胞和巨噬细胞表面的Fcγ受体（Fcγ receptor，FcγR）ⅡB，促进OX40受体多聚体和细胞内TNF受体相关因子六聚体的形成，引起下游信号传导，介导激动活性。由于潜在的激动活性会引发安全性风险，因此对抗OX40抗体激动活性的鉴定及抗体结构和功能的优化具有重要的意义。

Tsuji等报道，D270E突变可以降低IgG1与FcγRⅡB的结合活性。本实验室通过杂交瘤筛选技术获得1株靶向人OX40胞外段蛋白的抗体Ab18。本研究将D270E突变引入Ab18（IgG1型抗体）的Fc段中以降低其与FcγRⅡB的结合活性，进一步降低激动活性和增强安全性。研究表明，M428L/N434S（LS）突变可显著延长抗体半衰期。本研究对抗OX40抗体Ab18引入了LS突变，旨在通过对抗体Fc段优化及功能鉴定，获得新型的有望用于AD治疗的抗体先导分子。

Jurkat-OX40-NFκB-luc（简称Jurkat-OX40）细胞购自中国食品药品检定研究院；Jurkat-FcγRⅢA-NFAT细胞、FreeStyle-293-F细胞购自美国Thermofisher公司；hFcRn-CHO-K1细胞和hFcγRⅡB-CHO-K1细胞购自吉满生物科技（上海）有限公司，HEK293-hOX40稳转株细胞及hOX40L-hFc（人）、hOX40-mFc（人）、RheOX40-mFc（恒河猴）、mOX40-mFc（小鼠）、RatOX40-mFc（大鼠）融合蛋白和IgG1同型对照抗体由上海生物制品研究所有限责任公司（上海公司）第一研究室自行制备；GBR830和KHK4083序列通过公开来源的人IgG1抗OX40抗体重链和轻链序列（WHO国际非专利名称列表122和125）合成，由南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成基因合成，上海公司第一研究室自行表达纯化；Ab18及其突变体由上海公司第一研究室在293F细胞中用聚乙烯亚胺瞬时转染表达；Bio-Glo^TM萤光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；羊抗人IgG-Fc-HRP二抗购自美国KPL公司，羊抗人IgG-Fc-PE二抗购自美国Southern Biotech公司，鼠抗人CD3/CD28和Stain Buffer（FBS）购自美国BD Biosciences公司；定点突变试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。SpectraMax M5酶标仪购自美国Molecular Devices公司，NovoCyte Advanteon流式细胞仪购自美国Agilent公司。

将hOX40-mFc、RheOX40-mFc、mOX40-mFc、RatOX40-mFc重组蛋白1 μg/ml在96孔板中4 ℃包被过夜。加5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜。洗涤后，将抗OX40抗体连续3倍梯度稀释，37 ℃孵育1 h。洗涤后，加入羊抗人IgG-Fc-HRP二抗，37 ℃孵育45 min。用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物显色，终止反应后，使用SpectraMax M5测量450 nm处光密度值。

将HEK293-hOX40细胞或hFcγRⅡB-CHO-K1细胞在预冷Stain Buffer（FBS）中洗涤2次，加至96深孔板中，每孔5×10⁵个细胞。将连续梯度稀释的抗OX40抗体与HEK293-hOX40细胞或hFcγRⅡB-CHO-K1细胞在冰上孵育1 h。细胞洗涤2次后，加入羊抗人IgG-Fc-PE二抗，冰上避光孵育45 min。使用NovoCyte Advanteon流式细胞仪系统检测分析染色细胞样品。检测抗OX40抗体与人新生儿Fc受体（human neonatal Fc receptor，hFcRn）结合活性的实验操作与上述实验方法相似。分别使用pH6.0和pH7.4的PBS，评估抗OX40抗体和hFcRn-CHO-K1细胞在pH6.0和pH7.4条件下的结合活性。

将Jurkat-OX40细胞与60 μg/ml的OX40L-hFc和连续稀释的抗OX40抗体共同孵育在含0.5%胎牛血清与1 μg/ml抗人CD3和抗人CD28抗体的RPMI1640培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育16 h。随后，向每孔加入Bio-Glo萤光素酶检测试剂100 μl，并使用酶标仪读取全波长信号，记录相对光单位值。

分别构建编码Ab18的重链和轻链质粒，使用点突变试剂盒对Ab18的Fc段进行突变，获得以下Ab18突变体抗体：（1）Ab18v1具有D270E突变；（2）Ab18v2具有M428L和N434S突变；（3）Ab18v3具有D270E、M428L和N434S突变。

抗OX40抗体的激动活性采用Jurkat-OX40细胞报告基因法评估。将hFcγRⅡB-CHO-K1细胞加至96孔板，100 μl/孔、每孔5×10⁴个细胞，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜。每孔去除95 μl培养基，加入连续梯度稀释的抗OX40抗体和Jurkat-OX40细胞，在37 °C孵育16 h。效应细胞与靶细胞的比例为2∶1。然后加入萤光素酶试剂，用酶标仪读取相对光单位值。

抗OX40抗体的ADCC活性采用报告基因法进行评估。将HEK293-hOX40细胞加入96孔板，每孔5×10⁴个细胞，在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育过夜。过夜孵育后，从每孔移去95 μl培养基。将连续梯度稀释的抗OX40抗体和Jurkat-FcγRⅢA-NFAT细胞加入板中，在37 °C孵育6 h。效应细胞与靶细胞的比例为6∶1。然后加入萤光素酶试剂，用酶标仪读取相对光单位值。

使用GraphPad Prism 9软件作图，中心值对应均值，误差线表示标准差。

使用ELISA检测Ab18与不同物种（人、恒河猴、小鼠和大鼠）OX40的结合活性与特异性，结果见图1。Ab18对人类（图1A）和恒河猴（图1B）的OX40胞外段表现出较高的结合活性，半数效应浓度（median effect concentration，EC₅₀）值分别为87.5和37.9 ng/ml。Ab18对小鼠（图1C）和大鼠（图1D）的OX40胞外段表现出较弱的结合活性，而GBR830和KHK4083无明显结合活性。

用FCM检测了Ab18、GBR830和KHK4083与HEK293-hOX40细胞的结合活性，Ab18与HEK293-hOX40细胞的结合活性EC₅₀值为366.9 ng/ml，与GBR830和KHK4083相近（图1E）。

hOX40L-hFc蛋白对Jurkat-OX40细胞具有剂量依赖的激活作用（图2A）。使用Jurkat-OX40细胞阻断活性报告基因法检测抗OX40抗体对OX40L与OX40结合的阻断，结果显示，Ab18有效阻断了hOX40L-hFc对Jurkat-OX40的激活作用，阻断活性半数抑制浓度为657.3 ng/ml（图2B），KHK4083的阻断活性与Ab18相近，而GBR830的阻断活性较弱。

使用Jurkat-OX40细胞激动活性报告基因法检测抗体对OX40的激动作用，Ab18、GBR830和KHK4083抗体对Jurkat-OX40细胞均具有激动活性(图3A)。使用定点突变技术对Ab18 Fc段进行工程化改造。使用体积排除色谱评估了Ab18、Ab18v1、Ab18v2、Ab18v3与阳性对照抗体GBR830、KHK4083的纯度，分别为97.82%、97.98%、98.32%、98.31%、99.91%和98.67%，单体纯度均超过97％。

通过Jurkat-FcγRⅢA-NFAT细胞报告基因法，检测抗体引起的ADCC杀伤。Ab18及其突变体对Jurkat-FcγRⅢA-NFAT细胞具有ADCC，Ab18的ADCC活性EC₅₀值为25.7 ng/ml（图3B），突变后的Ab18v1、Ab18v2和Ab18v3具有与Ab18相近的ADCC活性，均强于GBR830和KHK4083。

采用FCM检测Ab18及其突变体与hFcγRⅡB-CHO-K1细胞的结合活性。Ab18v1和Ab18v3与hFcγRⅡB-CHO-K1细胞的结合活性明显低于Ab18（图3C）。此外，Jurkat-OX40细胞报告基因法检测的Ab18对OX40激动活性的EC₅₀为14.9 ng/ml，Ab18v1和Ab18v3的激动活性弱于Ab18（图3D）。D270E突变显著减弱了Ab18与hFcγRⅡB的结合能力和对OX40的激动作用。

采用FCM检测Ab18及其突变体在pH6.0和pH7.4下与hFcRn的结合活性。在pH6.0条件下，Ab18v2、Ab18v3与hFcRn结合活性增强，EC₅₀值分别为218.3和114.9 ng/ml（图4A）。M428L/N434S突变显著增强了Ab18突变体在pH6.0条件下与hFcRn的结合能力。Ab18及其突变体在pH7.4下与hFcRn无明显结合（图4B）。

在Ⅱb期临床试验（NCT03703102、NCT03568162）中，抗OX40抗体KHK4083和GBR830均表现出良好的疗效和安全性。本实验室通过杂交瘤技术筛选得到的Ab18与人OX40和HEK293-hOX40稳转株细胞均有较强的结合活性，且表现出与KHK4083相近的阻断活性，表明Ab18具有治疗AD的潜力。本研究检测了Ab18、GBR830和KHK4083的种属交叉结合活性，发现Ab18具有与小鼠、大鼠和恒河猴OX40的交叉结合活性，为后续在动物模型上评估Ab18抗体的体内生物学活性和药物安全性建立了基础。

本研究结果显示，Ab18、GBR830和KHK4083均具有不同程度的激动活性，表明3株靶向OX40的阻断抗体同时具有FcγRⅡB介导的激动活性。由于OX40的激活会促进T细胞扩增和存活，增强免疫应答，在自身免疫性疾病中可能加剧炎症，因此有必要减轻或去除抗OX40抗体的激动活性。本研究选择了D270E氨基酸突变进行Fc段优化，结果显示由FcγRⅡB受体介导的Ab18抗体激动活性降低。由于多种抗TNF受体家族，包括抗OX40、CD40、DR5和CD95抗体存在由FcγRⅡB介导的抗体激动活性，因此本研究对其他低激动活性抗TNF受体家族抗体的开发可能具有借鉴意义。此外，本研究还在Ab18抗体Fc段引入了LS突变，增强了Ab18与hFcRn之间在pH6.0条件下的结合活性。这表明Ab18 LS突变体具有延长抗体体内半衰期的潜力，未来在临床开发中可减少用药频率，减轻AD患者的治疗负担。

本研究通过Fc段工程化改造成功优化了Ab18，并初步评估了Ab18突变体的生物学活性；优化后的抗体具有低激动活性和hFcRn高结合活性，且保持了原有的ADCC活性，后续仍需对Ab18突变体的体内外生物学活性和药物安全性开展进一步研究，完善其功能评价，为Ab18用于AD治疗建立更全面的基础。

王明辉¹  梁红远¹  张坤明¹   瞿爱东¹  陈哲文²

¹上海生物制品研究所有限责任公司第一研究室， 上海 200051；²上海生物制品研究所有限责任公司， 上海 201403

通信作者：陈哲文，

Email：13917843916@163.com

引用本文：王明辉, 梁红远, 张坤明, 等. 新型抗OX40抗体Ab18的Fc段改造与鉴定 [J]. 国际生物制品学杂志, 2024, 47(5): 269-274.  

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240524-00031