摘要：在当前形势下，免疫接种至关重要，因为它能保护我们免受传染病原的侵害。尽管疫苗学领域取得了巨大成功，但我们不仅需要开发安全、理想的疫苗来对抗致命感染，还需要在部分或不一致的保护方面提高现有疫苗的质量。通常，亚单位疫苗被认为是安全的，但它们大多无法产生最佳免疫反应。因此，通过新型佐剂的配方改进疫苗的潜力有很大的可能性，这些新型佐剂能有效提供更强的免疫力。与新型佐剂配方的疫苗也可能有助于对抗抗原多样性高的病原体。然而，由于安全性和毒性的限制，很少有人类兼容的佐剂获得批准。在这篇综述中，我们主要关注新疫苗和改进疫苗的需求；佐剂的定义和需求；人类兼容佐剂的特性和机制；疫苗佐剂的现状，粘膜疫苗佐剂和临床开发中的佐剂；以及未来的发展方向。
1.引言
疫苗的发明被认为是医学研究的一项胜利。免疫接种不仅阻止了儿童期间的感染传播，而且为某些疾病提供了终身保护。然而，科学界在开发针对许多传染病的理想疫苗方面仍面临挑战，例如，瘟疫、结核病、疟疾、人类免疫缺陷病毒（HIV）和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2），因为存在免疫学障碍，如对疫苗的免疫反应不足和免疫记忆弱。除了这些障碍，疫苗安全问题，如在患有罕见遗传疾病的人群中产生的不良反应，由白喉和破伤风类毒素以及全细胞百日咳（DTwP）引起的系统性和局部反应原性，以及由白喉和破伤风类毒素以及无细胞百日咳（DTaP）显示的逐渐减弱的免疫力，被认为是不可接受的，这进一步增加了解决新兴或再出现疾病威胁的疫苗问题的挑战。这些挑战需要新的战略，以帮助理解免疫接种的免疫反应，并引入新的方法来在不牺牲质量和安全的情况下诱导强大的免疫力。全球科学界最近见证了重大的疾病爆发，即2003年的SARS、2009年的H1N1流感大流行、2014年的埃博拉病毒、2017年的马达加斯加瘟疫、2018年的印度尼帕疫情，以及迄今为止最引人注目的COVID-19大流行。2014年，埃博拉疫情在发达国家造成了巨大恐慌，因为在西非国家的死亡率相当高。这些事件迫使科学界不仅要保持警惕，而且要开辟新途径，追求新战略，以阐明开发针对这些新兴病原体的有效疫苗的机制性方法。目前，正在进行的COVID-19大流行严重影响了全球人类生活，破坏了全球经济；因此，广大科学界正忙于开发针对SARS-CoV-2的有效和安全疫苗。目前，灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗是人类可获得的四种疫苗类型。减毒活疫苗包含可以在宿主体内复制的整个病原体，并诱导强烈的免疫反应。减毒活疫苗已被观察到对脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎和风疹（MMR）、水痘、流感、轮状病毒和黄热病最有效。通过热或化学物质灭活的全病原体疫苗（灭活脊髓灰质炎（Salk）和甲型肝炎）是非传染性的，并且大多是安全的。灭活（杀死）疫苗已被观察到诱导弱和短期免疫力，因此需要加强剂来实现完全保护。研究发现，印度的DTwP是一种获得许可的灭活疫苗，它绕过了逐渐减弱的免疫力，并显示出长期保护效果。与灭活全病原体疫苗类似，纯化或重组亚单位疫苗不包含病原体的活成分，但它们只包含病原体的抗原部分，这使它们与前者不同。亚单位疫苗抗原的免疫原性较差，因此需要添加成分以增强其保护性免疫力。亚单位疫苗有时使用表位，这些表位被显示为识别和与T细胞或免疫球蛋白相互作用。亚单位疫苗通常在毒性和反应原性方面是安全的，因为亚单位疫苗包含纯化或重组抗原，而不是整个细胞。有一些非常成功的亚单位疫苗例子，如乙型肝炎病毒（HBV）、流感病毒（注射）和百日咳疫苗。开发的亚单位疫苗被发现免疫原性较差，因此，需要多次加强剂和适当的佐剂化来增强其保护潜力。最近，在COVID-19大流行期间，mRNA疫苗（核酸疫苗）被发现发挥了重要作用。这些基于mRNA的疫苗通过指导抗体的产生提供良好的免疫反应，从而预防严重并发症。
2.对佐剂的需求
佐剂最初由法国科学家加斯顿·拉蒙（Gaston Ramon）在1920年发现，他的研究结果表明在疫苗中加入铝盐可以增强其潜力。“佐剂”一词源自拉丁语单词adjuvare，意为“帮助”。佐剂通常不具有免疫原性，但它们与给定疫苗一起调节免疫反应，从而不仅减少所需的疫苗剂量，还延长免疫记忆。通常，疫苗与合适的佐剂配方，以增强对接种疫苗抗原的免疫反应，评估阻止传染的潜力。佐剂的另一个重要作用是指导体液和细胞介导的免疫反应，以产生针对病原体的特异性免疫。
目前，佐剂被利用于（a）增强对给定疫苗的免疫反应，增强抗体反应和接种疫苗的接受者数量；（b）增强因年龄、疾病或治疗干预而反应减弱的个体的血清转化率，例如，使用佐剂MF59与流感疫苗一起，以改善/增加老年人的反应；以及（c）减少疫苗抗原的剂量和加强剂的数量，因为佐剂的能力，即使用相当低量的疫苗抗原也能产生相似的反应，可能在疫苗生产设施有限且公众普遍急需免疫的地区至关重要。对需要多次加强剂的疫苗的需求在全球范围内提出了值得注意的挑战。佐剂可以减少提供完全保护所需的加强剂数量（图1）。
图1 疫苗佐剂及其益处的示意图。
将疫苗与佐剂配方的另一个原因是获得免疫反应的质量调节。佐剂在未充分发展的疫苗中被更广泛地使用，以调节疫苗抗原在没有佐剂的情况下不能够有效刺激的免疫反应类型。佐剂在临床前和临床研究中被使用（i）以提供功能适当的免疫反应（例如，体液或细胞，Th1、Th2和Th17）；此外，已观察到平衡的Th1/Th2/Th17反应增加了T细胞反应的持续时间并延长了小鼠的存活时间；（ii）增强长期记忆细胞（例如，T细胞记忆）；（iii）提供在大流行中可能至关重要的初始快速反应；以及（iv）修改反应的广度、特异性或亲和力（图1）。在这篇综述中，我们的主要目标是关注使用各种佐剂调节免疫反应。
3.特性和作用机制
3.1.铝盐（明矾）
铝盐已在临床上获批，是人体疫苗中最广泛使用的佐剂。这些佐剂由用于吸附疫苗抗原的磷酸铝和氢氧化铝沉淀物组成。Brenntag Biosector、Chemtrade和SPI Pharma™是一些准备这些配方的制造商。Alhydrogel®、Rehydragel™和AdjuPhos®是市场上可用的明矾的商品名。
作为佐剂的铝盐已在疫苗研究中使用了80多年，通常刺激Th2类型的免疫反应。明矾已被批准作为许可的人类疫苗的成分，即b型流感嗜血杆菌（Hib）、甲型和乙型肝炎病毒、破伤风、脑膜炎球菌病毒、人乳头瘤病毒（HPV）、白喉，以及最近的SARS-CoV-2。明矾作为佐剂的作用机制几乎已知，现在清楚的是，沉积物形成不是明矾作为佐剂活性的必要步骤。明矾作为佐剂主要唤起先天免疫。明矾刺激B细胞分化以增加抗体产生。也有充分记录表明，明矾在小鼠中刺激Th2类型的免疫反应，但在人类中，几乎所有与明矾佐剂配方的疫苗抗原都诱导混合类型的反应，即Th1和Th2。明矾触发NLRP3炎症体在体外用脂多糖（LPS）对巨噬细胞和树突状细胞（DCs）进行初步培养后表达白介素（IL）-1b。然而，在体内，明矾的佐剂性并不支持数据。已观察到明矾刺激Th2类型的免疫反应，并产生IL-4、IL-5、IgG1和IgE。明矾执行的另一项功能活动是通过使用DCs进行肌动蛋白介导的吞噬作用，从而启动信号级联，导致激活两个激酶蛋白（Src和Syk），进而动员Ca2+，最终激活转录因子NFAT（钙调磷酸酶-活化T细胞核因子），导致产生IL-2。此外，明矾通过激活补体蛋白级联来介导其佐剂性。作为佐剂的明矾由于其安全性、疫苗抗原稳定化以及调节高产量和持久抗体滴度而具有很高的优势。与明矾佐剂配方的疫苗不能被过滤灭菌、冻干或冷冻。
3.2.水包油乳液形式的佐剂（油包水）
3.2.1.MF59 和 AS03 佐剂
MF59 是一种非常安全有效的油包水乳液，由角鲨烯油制成。与弗氏佐剂不同，角鲨烯更容易被代谢，并且经过高度纯化，用于疫苗开发。最近，MF59 被 Fluad™（Seqirus，墨尔本，澳大利亚）授权作为一种重要的流感疫苗成分，用于老年人，并且后来也成功地用于婴儿和儿童。除此之外，它还被授权用作针对 H1N1 的大流行疫苗，用于儿童、婴儿和孕妇。从研究结果来看，含有 MF59 佐剂的三价灭活流感疫苗（TIV）在婴儿中引发了比不含 MF59 佐剂的流感疫苗更强的体液和细胞免疫反应。MF59 佐剂的配方显著调节了流感疫苗在婴儿中的弱效性。随后，与 MF59 佐剂配方的乙肝疫苗被观察到比氢氧化铝诱导了强 100 倍的免疫反应。与其他佐剂类似，MF59 的作用机制尚未完全阐明。MF59 佐剂的有效性并不依赖于在接种部位形成储库，因为 MF59 的半衰期很短。然而，MF59 佐剂显示出了引发强烈 IgG 和细胞介导免疫反应的潜力。此外，MF59 可以诱导单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DCs）表达和分泌趋化因子，即 CCL4、CCL2、CCL5 和 CXCL8，这些趋化因子招募更多的白细胞重新摄取更多的疫苗抗原。最后，这种分化将免疫细胞转化为抗原呈递细胞（APCs）。此外，这些 APCs 迁移到淋巴结，在那里它们诱导适应性免疫反应，如图 2 所示。
图2 MF59佐剂及其作用机制。在注射部位，MF59佐剂激活的巨噬细胞分泌趋化因子，这些因子刺激并招募免疫细胞。分化将免疫细胞转变为抗原呈递细胞，以激活B细胞和T细胞，从而产生强烈的体液和细胞免疫反应。
AS03 也是一种油包水乳液佐剂，包括角鲨烯、α-生育酚和聚山梨醇酯 80。将 α-生育酚纳入 AS03 配方使其与其他油包水乳液佐剂不同。AS03 最初是与抗疟疾疫苗一起使用的。最近，这种佐剂已被用于人类流感疫苗接种。最近的临床试验表明，含有 AS03 佐剂的流感疫苗引发了强烈的免疫反应。此外，含有 AS03 佐剂的疫苗也被发现在婴儿中诱导了强烈的免疫反应。此外，AS03 通过刺激核因子κB（NF-kB），一种促炎细胞因子，和趋化因子来唤起免疫。随后，它招募了如单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞。将这种佐剂应用于大流行疫苗配方的优势在于其能够用更低剂量的疫苗抗原产生强烈的体液免疫反应，即每株 3.75 或 7.5 毫克，与传统的三价灭活流感疫苗中每株 15 微克相比。自 2009 年以来，约有 470 万剂 AS03 佐剂的 A(H1N1) 疫苗已用于儿童接种。
3.2.2.军用脂质体配方
这种配方由美国军方开发，由胆固醇和含有饱和磷脂和单磷酰脂 A（MPLA）的脂质体组成。军用脂质体配方（ALF）有改进版本，即吸附到氢氧化铝上的 ALF（ALFA）、含有 QS21 皂甙的 ALF（ALFQ）和吸附到氢氧化铝上的 ALFQ（ALFQA）。研究发现，用 ALFA 佐剂的疟原虫周孢子蛋白疫苗候选物提供了足够的体液和细胞免疫反应。沃尔特里德陆军研究所（WRAIR）疟疾疫苗分支开发并测试了 FMP013（法氏疟疾蛋白-013）和 FMP014（自组装蛋白纳米颗粒）SAPN（两种新的合成疟疾抗原）与 ALFQ 佐剂的保护效力。
用 ALFA 佐剂的重组 gp120 诱导了针对不同亚型 HIV-1 的交叉反应性抗体。关于 ALF 和 ALFQ 与重组 HIV-1 包膜 gp140 蛋白的配方，ALF 诱导了主导的 Th2 型免疫反应，而 ALFQ 诱导了更平衡的 Th1 和 Th2 型免疫。此外，ALFQ 佐剂激活先天免疫反应，上调 APOBEC3（载脂蛋白 B mRNA 编辑酶催化多肽样家族），一种抗 HIV 蛋白，并维持促炎环境，结果，允许 HIV-1 感染的 MDMs（单核细胞衍生的巨噬细胞）变得能够限制 HIV-1 感染。
3.2.3.病毒体（脂质和糖蛋白）
病毒体具有佐剂系统的特性，以其可生物降解和无毒性而闻名。通常情况下，病毒体不会产生抗病毒体抗体。病毒体是小型球形单层脂质膜囊泡（150纳米），嵌入有病毒包膜蛋白，如流感病毒的神经氨酸酶和血凝素。这些蛋白被整合到磷脂酰胆碱双层脂质体中。这些制备的病毒体不包含核衣壳，包括源病毒的遗传物质。这些蛋白促进病毒体膜与细胞受体结合，介导与免疫细胞的pH依赖性融合。因此，病毒体将其内容物，即疫苗抗原（s），直接运送到目标细胞，引发抗原特异性免疫反应，同时携带的免疫原性较弱。病毒体是类病毒颗粒，允许疫苗抗原呈现给主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类，以引发B细胞和T细胞免疫反应。病毒体佐剂系统引发的免疫反应类型取决于抗原表位是在病毒体外还是体内。有一些已建立的例子，如PeviPRO™，它诱导体液免疫反应。抗原在细胞的内体中被降解，因此主要产生MHC II抗原呈递。PeviTER™配方的抗原不仅引发CD4+和CD8+ T细胞免疫反应，还产生强烈的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。病毒体佐剂系统通过MHC I途径呈递疫苗抗原，因为抗原自然地被送入抗原呈递细胞（APC）的细胞质中。批准的疫苗如Epaxal®（用于甲型肝炎）和Inflexal®V（用于流感）已成功证明病毒体的卓越性能。迄今为止，这些甲型肝炎（Epaxal®）和流感（Inflexal®V）疫苗已被授权在45多个国家使用，至今已有超过1000万人接种疫苗。这种新一代疫苗提供了额外的好处，因为它们即使在免疫抑制患者和婴儿中也有效。此外，它们具有高安全性，因为嵌入的病毒不会复制。据我们所知，病毒体不再被授权用于人类。
3.2.4.AS04（明矾吸附TLR-4激动剂）
为了开发新型佐剂系统，已经使用了以不同Toll样受体（TLR）激动剂吸附在明矾上的铝盐。佐剂系统04（AS04）已被批准用于与HPV（Cervarix）和HBV（Fendrix）疫苗的配方中。这种佐剂系统包括明矾和主要构成3-O-去酰基-4'-单磷脂A（MPLA）的脂多糖（LPS）来自 Salmonella minnesota。有文件记录MPLA保留通过与TLR-4相互作用刺激先天免疫的能力。它进一步导致诱导NF-kB信号传导和产生促炎细胞因子和趋化因子，招募免疫细胞到疫苗接种地点和引流淋巴结。在疫苗接种后的几小时内观察到单核细胞和DCs数量的增加，它们相互作用以刺激抗原特异性T和B细胞产生强烈的细胞和体液免疫反应。明矾与MPLA没有显示出协同效应；然而，MPLA和AS04的比较研究表明，明矾延长了MPLA在疫苗接种地点引起的细胞反应。因此，研究发现AS04佐剂通过刺激TLR-4诱导先天免疫反应。AS04佐剂的HBV疫苗在人类中引发先天免疫反应。与明矾佐剂的HBV免疫血清相比，在AS04佐剂的HBV免疫血清中观察到IL-6和C反应蛋白的水平升高。然而，报告的HBs Ag特异性T细胞和抗体水平高于明矾配方的HBV疫苗所诱导的水平。与明矾佐剂配方的相同疫苗相比，AS04配方的HBV和HPV疫苗引发更强的体液免疫反应，这表明TLR4激动剂MPLA佐剂对人类使用的重要性。
3.2.5.RC-529佐剂
LPS的连续酸和碱水解产生MPLA，已知MPLA保留LPS的各种免疫刺激功能。体外研究表明MPLA激活并刺激DCs的成熟，并上调人类白细胞抗原-DR、CD80、CD86、CD40和CD83。MPLA也已知诱导Th1和Th2细胞因子的表达并增强抗原特异性Tc细胞反应。MPLA是一种批准的佐剂，已用于乙型肝炎疫苗配方中。在此之后，合成模拟物如氨基烷基葡萄糖胺4-磷酸盐（AGPs）被表征，观察到它们激活先天细胞如巨噬细胞、DCs、B细胞和APCs。一种这样的AGP化合物RC-529，观察到通过TLR-4激活信号并上调细胞表面的共刺激分子，包括细胞因子和趋化因子。RC-529在临床试验中被发现是一种有效的佐剂，健康志愿者接受了针对乙型肝炎的疫苗配方。与明矾相比，RC-529在接受了疫苗配方的受试者中诱导了显著高水平的抗体产生。MPLA的合成模拟物RC-529在临床试验中被观察为安全有效。
4.粘膜疫苗佐剂
这些佐剂唤起宿主的先天免疫系统，帮助提供针对病原体的保护。使用活减毒或灭活病原体的全细胞基础疫苗通常包含内源性佐剂，如细菌细胞壁的产物及其基因组DNA/RNA。这些佐剂作为病原体相关分子模式（PAMPs），足以刺激适应性免疫。然而，亚单位疫苗通常缺失或无法诱导先天免疫反应，因此，包含佐剂对于提供成功的疫苗至关重要。大多数病原体通过鼻或口途径进入宿主。因此，有效的粘膜疫苗对于预防这类粘膜传播疾病至关重要。与肌肉注射/亚单位疫苗相比，粘膜疫苗提供了显著的好处，如低成本、非侵入性，以及最重要的是，传播血液传播感染的风险极低，尤其是对幼儿。然而，由于缺乏理想的粘膜佐剂，只有少数粘膜疫苗被批准用于人类。通常，粘膜佐剂有两个作用：首先，它们作为递送载体，其次，它们作为免疫刺激分子。然而，一些粘膜佐剂表现出免疫刺激剂和递送系统的双重特性，如壳聚糖及其衍生物。有文件记录粘膜佐剂可以刺激对成功粘膜免疫接种至关重要的保护性局部和系统免疫。此外，粘膜佐剂在提供针对远端和局部感染部位的保护方面发挥许多重要作用。例如，胞嘧啶-磷酸硫代鸟嘌呤（CpG）寡脱氧核苷酸作为通过鼻途径接种疫苗的有效粘膜佐剂，针对通过输血和性活动传播的病原体。此外，粘膜佐剂是对抗肿瘤免疫的强有力刺激剂。在众多粘膜佐剂中，TLR激动剂和突变型肠毒素是两种最具吸引力的类型，因为它们不仅有效，而且相对安全。迄今为止，细菌衍生的腺苷二磷酸（ADP）-核糖基化肠毒素是最有特色的粘膜佐剂。这类药物包括大肠杆菌热敏肠毒素（LT）、霍乱毒素（CT）以及LT和CT的突变体/亚单位。这些毒素刺激包括CTLs、Th1、Th2和Th17在内的抗原特异性细胞和体液免疫反应。最重要的是，这些佐剂在通过粘膜途径给药时刺激针对疫苗抗原的抗原特异性IgA抗体和持久记忆细胞。
5.热敏毒素/双突变热敏毒素粘膜佐剂如何工作？
粘膜佐剂LT是一种84 kDa的聚合蛋白。这种佐剂保持AB5的活性形式，包含一个A亚单位和一个五聚体B亚单位。dmLT是其母分子LT的突变形式。佐剂dmLT在通过粘膜或肠道途径接种疫苗后，免疫调节针对疫苗抗原的系统和粘膜免疫反应。它可以简单地与疫苗抗原（s）在水缓冲液中配制。由于佐剂的双重方法，即免疫刺激特性和普遍细胞结合，疫苗抗原（s）的细胞摄取量增加了许多倍，这就是粘膜免疫被增强的方式。这是递送疫苗配方，特别是亚单位疫苗到难以接近的部位，特别是舌下（s.l.）、口服（p.o.）和经皮（t.c.i.）递送的最适宜方法。这些策略不仅无针头，而且显示出增强给药便利性和依从性的能力。此外，它降低了使用危险注射接种疫苗传播疾病的风险。dmLT佐剂唤起针对疫苗抗原的强烈Th17反应，并诱导IL-17，它主要在粘膜部位提供保护。IL-17的表达有助于通过诱导B细胞分化为IgA分泌细胞，增加粘膜组织腔中分泌sIgA抗体的运输。dmLT佐剂还在肠道接种后刺激粘膜免疫反应。然而，这些研究只在动物模型中进行了测试，这种佐剂在人类中的使用还有待确定。LT、CT及其相关突变体在最近过去被很好地表征。LT或CT佐剂的活性形式AB5的亚单位具有独特的功能。亚单位B与受体结合并导致进入细胞。在粘膜接种疫苗期间，B亚单位有助于在整个粘膜部位运输疫苗抗原。亚单位A负责与ADP-核糖基化因子（ARFs）结合，并对Gsa进行ADP核糖基化，导致环磷酸腺苷（cAMP）的积累。然后，LT刺激树突状细胞（DCs）的激活、细胞因子的表达和Th17反应的刺激。也有文件记录，单独使用LT的亚单位A唤起混合Th1/Th2/Th17类型的免疫反应，但影响比LT的活性AB5形式弱。亚单位B的使用唤起Th2/T调节细胞（Treg）偏向的反应。然而，毒性一直是这些佐剂的关注点。
6.dmLT佐剂如何诱导免疫系统？
图3描述了免疫级联反应。（I）在接种疫苗部位，疫苗抗原被摄取后，激活先天免疫系统。上皮细胞分泌细胞因子和趋化因子，如IL-8和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）。（II）树突状细胞被招募到接种疫苗部位并激活以进行抗原处理和呈递给主要组织相容性复合体（Ag-MHC）。CD80和CD86的上调和极化细胞因子的分泌，例如IL-1、IL-23、IL-6和G-CSF，发生。（III）携带疫苗抗原的活化树突状细胞然后迁移到次级淋巴器官，并促进抗原特异性T辅助细胞和B细胞分化为分泌IgA和IgG抗体的浆细胞。最后，赋予混合Th1/Th2/Th17类型的免疫反应，特别是强烈刺激Th17细胞和粘膜归巢标记。有文件记录，Th17细胞是免疫的重要组成部分，促进次级淋巴器官中生发中心的形成，并增强IgA抗体分泌。
由LT/dmLT佐剂刺激的树突状细胞(DCs)因激活caspase 1炎症体和随后的趋化因子和细胞因子如IL-1和IL-23的表达，引发了非常高的Th17类型的免疫反应。科学研究表明，用LT激活的小鼠DCs诱导了IL-1b的表达，这对于Th17细胞的产生至关重要。用dmLT配方的疫苗抗原重新刺激免疫个体的人外周血单核细胞(PBMC)增强了IL-17A和IL-13的表达。总之，在用dmLT配方的疫苗抗原免疫后，发生了一系列明确的事件，这是一个有效的APCs和疫苗免疫的刺激剂。
图3 dmLT佐剂的作用机制。(I) 在接种部位，dmLT佐剂刺激先天免疫反应，激活的上皮细胞分泌IL-8和G-CSF。(II) 树突状细胞（DCs）在注射部位被激活并被招募，它们处理并呈递抗原。它还上调共刺激分子，即CD80和CD86，并刺激IL-1、IL-6、IL-23和G-CSF的表达。(III) 激活的DCs迁移到次级淋巴器官，在那里它们刺激抗体分泌浆B细胞的分化和抗原特异性Th细胞的产生。总体而言，赋予了强烈的Th17免疫反应。Th17细胞被确定为在免疫中至关重要，并在次级淋巴器官中刺激生发中心的形成以及增强IgA分泌。
7.作为粘膜疫苗佐剂的TLR激动剂
与基于TLR配体的佐剂配方的疫苗触发并激活先天免疫反应，有助于增强疫苗候选物所赋予的保护潜力。基于TLR的佐剂需要额外的适配蛋白MyD88，它刺激APCs和B细胞进行抗体产生。此外，MyD88信号也诱导生发中心的形成，这对于产生抗体分泌细胞至关重要。基于TLR配体的佐剂包括依赖TLR9的佐剂CpG DNA（CpG）和依赖TLR2的佐剂Porin B（PorB），它们都需要MyD88来适当刺激APCs。CpG是未甲基化的细菌DNA基序，而PorB是脑膜炎奈瑟菌的外膜蛋白。有文件记录TLRs在APCs上表达，包括巨噬细胞、DCs和B细胞。因此，使用TLR激动剂作为疫苗制备中的佐剂的主要目的是刺激这些细胞以赋予强大的免疫反应，连接先天和适应性免疫。各种TLR4配体不仅已在临床前研究中使用，而且已被食品药品监督管理局批准用于临床试验，如卡介苗（BCG）和MPLA。作为TLR4的已知配体的LPS，被用作体内急性炎症的诱导剂，用于小鼠模型中的肿瘤回归。据报道，TLR4激动剂，如第二代脂质佐剂SLA-SE，通过在小鼠模型中肌肉免疫接种肠毒素大肠杆菌（ETEC）疫苗抗原，促进粘膜抗体的增加。为了测试L-pampo的效果，一种TLR1/2和TLR3激动剂的组合用于SARS-CoV-2雪貂模型，引发了强烈的体液和细胞介导的免疫反应。最近，一种口服SARS-CoV-2疫苗（VXA-CoV2-1），目前正在进行III期临床试验，使用了双链RNA佐剂，主要针对TLR3并有助于通过该受体激活DC人群。这项研究中使用的佐剂不仅扩大了模式识别受体（PRR）目标范围，而且对于口服疫苗来说，是有前途的代替类毒素佐剂的选择。在我们看来，这种在粘膜免疫中发现的佐剂的进步可以为对抗病原体株提供新的希望，并能实现成功的疫苗设计。
8.佐剂和临床试验的现状
安全性一直是开发新型疫苗佐剂过程中的重大关切；因此，许多佐剂已在临床前和临床研究中进行了全面评估。非常常用的佐剂，例如氢氧化铝，已在美国获得批准。含氢氧化铝的疫苗在70多年前获得批准。与乳化剂MF59配方的流感疫苗于1997年获得许可并在欧洲上市。此外，与流感疫苗配方的乳化剂AS03于2009年获得许可。作为甲型肝炎和流感疫苗的重要组成部分，脂质体佐剂于2000年获得批准。此外，含有MPLA吸附到氢氧化铝的组合佐剂AS04已在欧洲获得批准，并在美国获得许可。已批准用于人类的佐剂列在表1中。
尽管提供了许多值得注意的好处，如降低成本、高产量和更安全的高纯度疫苗抗原，但大多数由于缺乏内在的免疫刺激因子如各种PAMPs，提供了较弱的疫苗潜力。了解免疫细胞受体如TLRs是如何被PAMPs刺激的，即革兰氏阴性细菌的LPS，以及适应性免疫反应是如何由先天免疫反应协调和调节的，是至关重要的。有报道称颗粒物质刺激先天免疫信号。因此，为了刺激先天免疫细胞上特定的受体，这些受体可以轻易地感知危险信号和细胞应激，已鉴定出佐剂。不幸的是，由于高反应原性和耐受性差，早期开发的佐剂无法达到临床发展。由于HIV和疟疾疫苗的特点，出现了不同佐剂组合是更好的选择以协同促进广泛的免疫反应，即体液和细胞反应的理由。这种佐剂的组合涉及一个传递系统，即脂质体、氢氧化铝或乳化剂，以及一个自然免疫刺激免疫增强剂，如细菌MPLA、病毒dsRNA或植物Quillaja皂甙。新一代佐剂大多被称为免疫刺激剂或免疫增强剂，已在人类中进行了测试，并正在进行临床试验，列在表2中。这些新一代佐剂系统是基于现有的药物传递模型和已建立的药物原则设计的。因此，传递系统主要在免疫信号激活上执行，可以局部化并集中在配方疫苗抗原上。GSK的佐剂系统（AS）是这种进步的最好例子，以制造有效的疟疾疫苗。
传递系统对疫苗开发有多重要？在GSK两种替代疫苗的人类临床试验中提到并强调了这一点。两种疫苗都含有相同的免疫增强剂，但它们的配方不同。含有AS01佐剂系统（脂质体配方）的疫苗比含有相同成分的AS02佐剂系统（乳化剂配方）的疫苗提供了更好的保护。因此，疫苗候选物RTS,S与佐剂系统AS01配方，这个例子证明了两种免疫增强剂的组合是必要的。佐剂系统AS01包含MPLA和皂甙QS-21。研究表明，当这两种免疫增强剂（MPLA和QS-21）在脂质体中配方时，它们协同工作并引发先天免疫反应，进一步增强适应性免疫反应。AS01佐剂系统刺激人类对各种疫苗抗原的强大T细胞免疫反应的能力是通过这种独特的免疫增强剂组合，例如MPLA和QS-21所赋予的协同效应来阐明的。这些发现为开发潜在的佐剂系统开辟了大门，并提供了新的途径。
大多数佐剂作为候选疫苗或已许可疫苗的理由从临床研究收集的数据中变得清晰。这些佐剂通常被认为能够非常迅速地在免疫部位刺激先天免疫反应，并及时将刺激的免疫细胞排入淋巴结，这对于增强针对病原体的特异性适应性免疫至关重要。PAMP和危险信号通路的刺激，即TLR、caspase-1和溶酶体不稳定-Syk/Card9，不仅促进了效应细胞的招募，包括T细胞和B细胞，还促进了APCs的招募和激活。许多研究通过靶向耗竭激活的APCs证明这一步对于有效诱导疫苗抗原特异性T细胞非常重要。将产生的抗原特异性T细胞表型的类型将取决于先天免疫信号激活的性质。被刺激的皮质下巨噬细胞分泌的IL-18可能促进分泌IFN-g的CD4+ T细胞的发展。同样，被刺激的APCs分泌的IL-6或IL-12也可能促进滤泡辅助T细胞（TFH）的产生，这促进了B细胞分泌高亲和力IgG，例如流感免疫。含有TLR配体的佐剂系统可以通过刺激具有更好TCR亲和力的T细胞克隆的扩张来调节克隆排列和抗原特异性T细胞库的质量。
Novavax, Inc.开发了一种名为matrix-M的重要佐剂。它基于从Quillaja saponaria（皂树皮树）树皮中提取的皂甙化合物。目前，matrix-M佐剂正在与针对SARS-CoV-2的重组刺突（S）蛋白配方中使用。目前，这种疫苗配方（COVID-19疫苗）处于I期临床试验。matrix-M佐剂不仅诱导产生高中和抗体滴度，还诱导强大的T细胞免疫反应，并对各种冠状病毒株提供高保护效果（193–195）。Matrix-M也已在其他疫苗配方中使用，如目前处于IIb期的疟疾疫苗（R21/Matrix-M）和已达到I期的流感疫苗。观察到像Q-21这样的皂甙通过在引流淋巴结的皮质下窦巨噬细胞（SSMs）中激活caspase 1来诱导OVA特异性CTL反应和高抗体滴度，通过在内吞作用后破坏溶酶体激活酪氨酸蛋白激酶SYK。此外，像matrix-M这样的皂甙在激活先天免疫系统、节省疫苗剂量和诱导体液和细胞介导的免疫反应中发挥着关键作用。然而，这种佐剂的分子机制仍有待阐明。这种佐剂的作用机制可以通过使用系统疫苗学方法来定义。
目前，机制方法和理由与佐剂疫苗在人类中的有效性和可接受性相关。这些信息可能有助于提供如何在非临床模型和临床中对新佐剂系统进行评估和表征的协议，以进行面对面比较。最近的一项研究表明，五种不同的佐剂疫苗只影响了针对疫苗抗原的CD4+ T细胞的数量，但未能调节这些细胞表型的范围。因此，佐剂并不总是对所有抗原的免疫反应质量产生影响。通常，疫苗的有效性在很大程度上依赖于疫苗抗原本身以及保护所需的免疫力类型，例如HIV疫苗研究。
9.在COVID-19大流行期间使用佐剂和未来展望
迄今为止，我们已经对新一代佐剂的免疫学有了深刻的见解，这些见解可能对提供未来开发新型佐剂疫苗的途径非常有帮助，通过选择适当的佐剂和抗原组合。随着组学和系统生物学的出现，人们可以轻松阐明理想疫苗刺激的复杂人类免疫反应。通过这些研究，可以将独特的分子签名与新表征的疫苗进行比较。此外，还可以开发和推进兼容的动物模型，以评估潜在的佐剂疫苗。此外，在临床中，大多数分子分析是基于外周血样本和非人灵长类动物模型进行的，这允许评估对免疫接种的局部免疫反应，并为已经可用的外周血签名提供逻辑验证的机会。对于新一代佐剂的快速开发，非临床研究在连接临床解释方面总是发挥着关键作用。
佐剂主要由天然成分组成。当前技术不断发展，新佐剂的开发也在不断进步；不久的将来，含有合成成分的佐剂将取得重要进展。尽管经过批准的佐剂始终被视为未来宝贵的资产，但许多这些佐剂的关键成分都是从自然资源中开发出来的，可以被具有类似功能的合成分子所替代。目前正在对有潜力成为更有效的激活剂和激动剂的新分子进行表征。这些分子可以以低成本大量高效生产，因为它们可以被轻松纯化和评估，并且对内在的生物变异性不太敏感。此外，这些合成分子的大规模生产过程可能不太容易受到获取和提取天然成分所面临的众多困难和挑战的影响。然而，在用这些新佐剂候选物替代现有佐剂中的天然成分之前，应该在临床试验中解决对疫苗配方中这些新佐剂候选物的安全性和保护效力的担忧。如前所述，在过去的100年中，已经研究了一些有前景的佐剂候选物；然而，只有少数佐剂被批准用于人类。由细菌Acinetobacter calcoaceticus产生的复杂酰化多糖乳化剂可能是一个好候选物，因为它可以进行结构定制，并且具有乳化行为。我们发现乳化剂可以激活巨噬细胞，并显示出显著的佐剂活性，这通过特异性抗体滴度来确定。这种免疫反应的特点是免疫球蛋白G2a滴度高，与Th1反应一致。这种复杂聚合物所展示的显著免疫增强作用确立了乳化剂作为一种令人兴奋的新佐剂候选物。我们提出，通过操纵乳化剂的化学结构，我们可以探索PRRs和巨噬细胞激活的物理基础。在过去的几年中，我们对先天免疫信号有了深刻的理解和丰富的知识，这为关注具有更高潜力的佐剂靶点提供了新的途径，即TLR、干扰素基因刺激因子（STING）、视黄酸诱导基因I（RIG-I）、C型凝集素受体（CLRs）、核苷酸结合寡聚化结构域、富含亮氨酸的重复和Pyrin结构域（NLRP），以及干扰素诱导蛋白（AIM2）。此外，一些复杂的探索性佐剂概念已经开发出来，包括包含许多不同组分的多聚体配方。尽管在临床前研究中取得了令人鼓舞的结果，但这些佐剂在理想的预防性疫苗中几乎没有任何作用，但如果治疗性疫苗的出现，如果能够解决大规模生产、稳健性、可重复性问题等，可能会有额外的途径。尽管在佐剂方面取得了巨大的进步，但仍有一些值得注意的限制，例如无法在人类中刺激强烈的CTL反应。然而，为了刺激广泛和多样化的免疫反应，佐剂也可以在包含核酸和载体的初次/增强背景下使用。已经尝试使用初次/增强技术来开发针对HIV的有效疫苗，并且在用载体进行初次免疫后，正在评估佐剂疫苗抗原作为增强蛋白。因此，临床研究对于定义异种初次/增强设置的最佳组合至关重要。通过使用更好的方法来表征新开发的佐剂，可以解决几个基本问题，即通过阐明先天免疫特有的信号级联，这是支持特定疫苗潜力所需的。疫苗效力特定的快速及时刺激的影响是什么？先天免疫反应的信号途径之间是否存在冗余？是否可能通过更特定的刺激获得更好的结果？先天免疫效应器（如细胞-细胞相互作用和细胞因子信号）与适应性免疫效应器（如B细胞和T细胞）之间的确切时间和空间关联是什么？这些反应是否是时间依赖的，即疫苗抗原和佐剂在接种部位停留的时间，以及局部APC是如何被激活的？在人类群体中，佐剂的特定免疫反应如何受到生态因素和个体遗传倾向的影响？同时使用的药物和已经患病的个体对免疫接种有何影响？
10.结论
免疫接种的最终目标是提供有效和持久的保护，以抵御各种传染病。这种免疫保护只能通过使用携带适当佐剂和抗原的疫苗配方来实现。佐剂是疫苗配方的重要组成部分，可以调节疫苗反应。早期的疫苗配方方法专注于单一类型的佐剂，即铝盐或乳液。然而，新的疫苗配方需要刺激明确定义的细胞和体液免疫反应。因此，为了引发强大的免疫反应，如体液和细胞免疫反应，迫切需要新的免疫增强剂或免疫刺激佐剂在疫苗配方中。粘膜佐剂dmLT是25年研究的成果。通过临床前和临床研究已经证明，dmLT是一种安全有效的佐剂，可以在适当的配方中诱导保护性免疫。需要关注一些未解决的问题，以改进dmLT佐剂，如抗原-佐剂组合的安全性和稳定性问题。dmLT所赋予的佐剂性和保护性免疫的诱导机制也值得进一步研究。已经建议dmLT可以促进婴儿的先天和适应性免疫反应。含有dmLT的疫苗制备已被发现对粘膜感染有效。已经得出结论，dmLT将有助于克服对其他整细胞或LPS基础疫苗（如霍乱、伤寒沙门氏菌和志贺氏菌疫苗）在经济欠发达国家的婴儿中的低反应性。我们预测，dmLT在婴儿疫苗制备中的使用将在未来非常有效。在最近的过去，我们已经在佐剂研究领域获得了许多见解；现在，我们可以选择一个合适的佐剂，而不是像免疫增强剂或其组合这样的经典佐剂，以增强疫苗效力。最近，铝盐、MF59、AS03、CpG和Matrix-M已经获得许可，并在全球范围内用于COVID-19疫苗制备。已经建议合成基因编码的刺突蛋白，无论是预融合稳定还是仅受体结合域，用于工程哺乳动物细胞、杆状病毒或植物细胞以生产重组蛋白，然后纯化、与佐剂结合并用作疫苗。在COVID-19疫苗制备期间，我们获得了与蛋白基疫苗结合使用许可佐剂的工业和临床知识，我们相信，基于这些方法的疫苗制备在未来将被良好耐受、有效，并且大量可用。此外，在COVID-19大流行期间使用RNA成熟和病毒载体创造疫苗开辟了新途径，以在未来为新出现的感染生产更有效的疫苗。最近完成的临床研究与新佐剂推荐在未来人类疫苗配方中使用一系列新的免疫增强剂或免疫刺激剂。这些新一代佐剂在不同组合中的可获得性将使成功疫苗的开发策略合理化。
