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基因治疗新突破：CRISPR系统免疫原性难题的创新破解
CRISPR-Cas系统作为基因治疗领域的革新工具，其潜力毋庸置疑。然而，这一技术的核心来自细菌的Cas核酸酶，当被用于人类体内时，免疫系统可能将其视为外来入侵者，触发免疫反应。这种预存免疫问题在多数健康个体中普遍存在，成为CRISPR技术迈向临床的一道难关。如何在保留基因编辑功能的同时降低免疫原性，是该领域亟需攻克的核心挑战。
提到CRISPR技术，就不得不提张锋院士。他在基因编辑领域的探索堪称开创性成就，率先将CRISPR-Cas9系统成功应用于哺乳动物和人类细胞，不仅奠定了该技术的基础，还推动其广泛应用于生物医学研究与疾病治疗。最近，张锋团队再次交出了一份令人瞩目的答卷。
解析Cas核酸酶免疫原性研究的科学探索
2025年1月2日，他们在《Nature Communications》期刊发表了题为“Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy”的研究论文，这项研究有望为基因治疗注入全新动力。
张锋团队针对目前广泛使用的SaCas9和AsCas12a两种核酸酶展开深入研究。他们通过MHC相关肽蛋白质组学（MAPPs）技术，系统分析了这些核酸酶的潜在免疫原性表位，揭示了导致免疫反应的关键区域。更重要的是，他们通过计算建模与实验验证，成功设计出了一系列优化后的变体，被称为“Redi变体”。这些变体不仅显著降低了免疫反应，还保持了出色的编辑活性和特异性，为基因治疗的安全性提升提供了全新解决方案。
这一突破性研究成果为解决CRISPR系统的免疫原性问题提供了切实可行的路径，同时也进一步拓展了基因编辑技术的临床应用可能性。从基础研究到技术优化，张锋团队的探索再一次证明了科学家在解决实际难题时的创造力和坚持不懈。未来，随着这些低免疫原性变体的应用推广，基因治疗将迈向更加安全、高效的新时代。
研究背景
CRISPR-Cas技术以其高效的基因编辑能力迅速成为生物医学领域的明星工具。然而，这些核酸酶来源于细菌和古细菌，作为外源蛋白进入人体时，可能引发免疫反应，成为潜在风险。特别是SaCas9和AsCas12a，尽管在编辑效率和特异性上表现出色，但其免疫原性可能会对临床应用形成障碍。因此，如何降低其免疫原性而不影响基因编辑功能，成为该领域的研究重点。本研究便是针对这一问题展开，通过系统性分析和优化，尝试破解这一难题。
研究方法
研究采用了严谨的多步骤设计，从体外到体内，逐步评估和优化核酸酶的免疫原性与功能性。首先，通过MHC相关肽质谱分析（MAPPs）技术，识别出核酸酶潜在的免疫原性表位。随后，利用蛋白计算建模和实验验证，设计出多种突变体以降低其免疫反应。最后，结合PBMCs培养、ELISpot实验和人源化小鼠模型，全面评估突变体的免疫原性及基因编辑能力。这种多层次的研究方法不仅具备逻辑性，还能从多个角度验证研究结果的可靠性。
研究内容
锁定目标：鉴定免疫原性表位
第一步，研究团队培养了表达SaCas9和AsCas12a的MDA-MB-231细胞，并通过MAPPs技术从细胞中提取MHC I类分子结合的肽段。这些肽段被视为潜在的免疫原性表位。随后，他们利用NetMHCpan工具预测这些表位的亲和力，以验证数据的可靠性。这一阶段奠定了后续突变设计的基础，同时通过多种分析工具交叉验证，确保了鉴定表位的准确性。
Fig. 1 | Prediction of SaCas9 and AsCas12a epitopes with reduced binding to MHC Imolecules.
精准调控：设计低免疫原性突变体
研究者基于SaCas9和AsCas12a的晶体结构，通过计算建模工具Rosetta设计了一系列突变体。突变的目标是在降低免疫原性的同时，保留核酸酶的活性和稳定性。为提高设计效率，他们针对每个免疫优势表位设计了多种单点突变、双突变和三突变。这些突变体随后被克隆入表达载体，并在细胞中进行表达和测试，为后续实验提供了物质基础。
Fig. 2 | SaCas9 and AsCas12a peptides with single point mutations are less immunogenic in vitro.
验证突变效果：体外免疫评估
研究进一步通过PBMCs培养、ELISpot实验和流式细胞术，评估突变体在体外的免疫原性。这些实验模拟了T细胞对表位的识别过程，检测了IFN-γ分泌量及CD8+ T细胞的活化水平。结果显示，与野生型相比，突变体显著降低了诱导免疫反应的能力。这一结果不仅证明了突变设计的有效性，还为突变体在临床应用中的安全性提供了证据。
Fig. 3 | SaCas9 and AsCas12a reduced immunogenicity (Redi) variants retain activity and specificity.
（4）双重验证：基因编辑效率与体内评估
最后，研究在细胞和人源化小鼠模型中验证突变体的编辑效率和免疫原性。在细胞实验中，突变体保持了与野生型相当的编辑效率，同时大幅降低了非目标位点的编辑频率。在体内实验中，突变体引发的T细胞反应和抗体水平明显低于野生型，同时在小鼠体内表现出稳定的基因编辑能力。这一结果进一步强化了突变体的应用潜力。
Fig. 4 | SaCas9.Redi variants show reduced immunogenicity in vivo.
讨论与讨论
研究表明，通过精准设计和优化，可以有效降低SaCas9和AsCas12a的免疫原性，并保持其基因编辑效率。这一成果为CRISPR技术的临床应用扫清了潜在障碍，也为其他外源蛋白的免疫优化提供了借鉴。然而，该研究也存在局限性，例如突变体的长期稳定性和免疫逃逸可能带来的风险仍需进一步研究。此外，不同HLA分型的人群对表位的识别可能存在差异，这需要在更大范围内验证。
个人见解
这项研究在技术层面展现了计算建模与实验验证的完美结合，为降低CRISPR免疫原性提供了可行路径。然而，未来的研究可以探索更具普适性的突变设计策略，以适应不同人群的免疫背景。此外，该研究的思路还可以拓展至其他基因编辑工具，甚至用于疫苗研发领域。这无疑是CRISPR临床化进程中的重要一步，也让我对基因编辑技术的未来充满期待。
下面葡萄和大家分享一下本篇文章的研究思路，希望对大家在今后的科研道路上有所启发。
第1部分：SaCas9和AsCas12a免疫原性表位的鉴定
（1）细胞培养与转染：培养MDA-MB-231细胞，将其转染表达SaCas9或AsCas12a的质粒，使细胞表达这两种核酸酶。（2）MHC相关肽质谱分析（MAPPs）：从转染后的细胞中提取HLA-A0201分子，通过质谱分析鉴定与MHC I类分子结合的肽段，从而确定SaCas9和AsCas12a的潜在免疫原性表位。（3）表位验证：利用NetMHCpan 4.1工具预测这些表位与HLA-A0201分子的结合亲和力，验证MAPPs分析结果的准确性。
第2部分：SaCas9和AsCas12a突变体的设计与构建
（1）计算建模与突变设计：基于SaCas9和AsCas12a的晶体结构，使用Rosetta蛋白设计包引入突变，旨在降低表位与MHC I类分子的结合亲和力，同时保持核酸酶的活性和稳定性。针对每个免疫优势表位，设计多个单点突变体。（2）突变体克隆与表达：将设计好的突变体序列克隆到相应的表达载体中，构建单点突变体、双突变体和三突变体的表达质粒，并在细胞中表达这些突变体蛋白。
第3部分：突变体免疫原性的体外评估
（1）PBMCs培养与刺激：从健康人类供体中分离外周血单个核细胞（PBMCs），将其与野生型和突变体表位肽共培养，模拟体内T细胞对这些表位的识别过程。（2）ELISpot实验：检测PBMCs在不同表位肽刺激下分泌IFN-γ的情况，评估突变体表位诱导T细胞免疫反应的能力，与野生型表位进行比较。（3）T细胞反应检测：通过流式细胞术检测突变体表位刺激下PBMCs中CD8+ T细胞的活化和增殖情况，进一步验证突变体免疫原性的降低效果。
第4部分：突变体基因编辑效率与特异性的评估
（1）细胞转染与基因编辑：将构建好的突变体表达质粒与目标gRNA共转染入人类细胞，利用CRISPR-Cas系统进行基因编辑。（2）编辑效率检测：通过PCR和测序等方法检测基因编辑位点的插入缺失（indel）率，评估突变体的基因编辑效率，并与野生型进行比较。（3）特异性分析：使用Tagmentation-based Tag integration site sequencing（TTISS）技术检测突变体在基因组中的非目标位点编辑情况，评估其基因编辑特异性。
第5部分：突变体免疫原性的体内评估
（1）人源化小鼠模型建立：使用人源化MHC I/II小鼠模型，该模型缺乏鼠MHC，表达人类MHC I和II复合体，用于模拟人体免疫系统对突变体的反应。（2）免疫反应检测：将突变体蛋白或编码突变体的AAV载体注射入小鼠体内，检测小鼠体内产生的针对突变体的T细胞反应和抗体反应，评估突变体在体内的免疫原性。（3）基因编辑效果评估：在小鼠体内进行基因编辑实验，检测突变体在体内的基因编辑效率和持续性，同时观察其对小鼠生理功能的影响。
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