导读：环状RNA（circRNA）因其稳定的闭环结构、持久的蛋白表达能力和低免疫原性而受到关注。由于circRNA独特的制备流程导致的副产物（如线性RNA前体和nicked circRNA），纯度是circRNA疫苗或药物的关键质量属性之一。
目前，监管机构尚未发布专门针对circRNA质量控制研究的指导性文件。据文献报道，常用的分析方法（如琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳）无法有效区分circRNA和nicked circRNA。有效的circRNA纯度分析方法仍有待开发。
本期文章，菌菌将参考中检院研发人员于2024年最新发表的文献，分享一种有效的circRNA纯度分析方法——RP-HPLC。
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cicrRNA纯度分析方法概览
首先是circRNA合成过程中的杂质类型。以当前主流的基于内含子自剪接环化的PIE环化方法为例，circRNA体外制备流程如下：首先是合成线性RNA前体（precursor RNA，pre-mRNA），这一过程与线性mRNA类似，通过体外转录（IVT）反应合成。随后，内含子自剪接完成RNA的环化。
经IVT和PIE环化后的反应体系中除目标circRNA外，还包括一系列的工艺相关杂质和产物相关杂质（副产物）。其中产物相关杂质包括：circRNA的开环异构体nicked RNA、线性RNA前体、剪接下来的内含子片段等。
据报道，circRNA中nicked RNA、RNA前体等线性RNA杂质，会引发先天性免疫反应。因此，开发有效的circRNA纯度和杂质分析方法对于circRNA的放行是必要的。
用于circRNA纯度分析的方法包括琼脂糖凝胶电泳（E-gel等）、毛细管电泳（CE）、尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和高效液相色谱（HPLC）。其中电泳法分辨率较低，虽能有效分离线性RNA前体和circRNA，但无法完全分离nicked RNA和circRNA。而中检院等发表的研究显示，基于反相（RP）-HPLC的方法能够实现circRNA、nicked RNA和线性RNA前体的基线分离。
02
中检院开发circRNA纯度分析方法
中检院研究人员通过色谱柱和流动相的筛选和优化，建立了一种适用于circRNA纯度和特定杂质分析的分离方法。该方法实现了circRNA、nicked circRNA和线性RNA前体的基线分离。
研究者验证了该RP-HPLC方法的特异性、定量限、检出限和精确度。特异性测试显示溶剂不会干扰RNA检测。circRNA、nicked circRNA和线性RNA前体的检出限分别为2.4、1.7和1.7ng/μL，定量限分别为7.1、5和5ng/μL。这些限度分析表明，该方法适用于质量研究。精确度分析同样满足要求，不同研究人员测试多个circRNA样品的相对标准偏差仅为0.6%。
综上，研究开发的RP-HPLC法可灵敏地分离circRNA、nicked circRNA和线性RNA前体。
图示 中检院基于RP-HPLC分离circRNA及相关杂质
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耀海生物开发circRNA纯度分析方法
2023年，耀海生物公开了一种circRNA产物分析的专利《一种基于RP-HPLC分析体外转录产物成分circRNA的方法》。该发明同样建立了一种RP‑HPLC分离程序，实现了circRNA、nicked RNA、线性RNA前体的完全分离。
该发明能有效鉴别经IVT和PIE环化后的各种反应产物，可应用于以下场景：
（1）用于计算成环率。该方法利用RP-HPLC将反应混合物中的环状RNA、nicked RNA、pre-mRNA完全分离开来，通过峰面积的百分比可以得出环状RNA的比例，即成环率；
（3）用于circRNA纯度和杂质的分析和检测。该方法具有良好的线性、精密度和重复性，符合《中国药典》相关规定；
（4）可放大用于circRNA纯化。该方法分离效果好，且能够线性放大，可进一步用于circRNA的大规模纯化。
图示 耀海自研RP-HPLC方法有效分离circRNA及相关杂质
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总结
鉴于circRNA结构和合成工艺的特殊性，目前尚无成熟的质量研究和分析方法。circRNA的纯度是其特有且关键的质量属性，建立成熟的纯化和分析方法是circRNA疫苗或药物开发的必要条件。
