做实验时常常会怀疑人生：明明已经按照实验室祖传标准流程一步步操作，但仍不是每一次都能够得到理想的结果！难道实验室传承多年的protocol也有bug？
太过相信标准流程，说不定就忽视了实验中“亿些”可以优化的要点！
那么如何避免一条protocol走到黑？
Abcam打造全新内容板块，一期一篇专题内容，重点讲解热门应用WB, IHC在实际操作过程中如何避免 “刻板印象” ，让我们一起学习如何科学的根据靶标特性优化实验流程吧！
大多数科研人员都或多或少的遇到过实验结果与预期不符的情况，如果你在预实验阶段就遇到了以上这些问题，希望大家第一时间查看最新版的产品说明书/文献，确认该靶标的翻译后修饰情况及其可能对结果产生的影响！
同时，Abcam一直致力于为客户提供高质量抗体，内部验证的脚步从未停下过，没准说明书中上新的图片和描述，就能够帮助你解决实验困扰！
//阅读下文，查看最新的Abcam内部实验室结果，快速了解翻译后修饰对蛋白条带的影响！
编码蛋白的基因在表达以后，通常还需不同翻译后修饰（Post translational modifications, PTMs），例如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化、泛素化等来发挥所需功能，这种翻译后修饰过程受到一系列修饰酶和去修饰酶等的严格调控，使得在特定瞬间或时期的细胞中，蛋白表现出持续稳定或动态的功能。
01
分子量变大：靶标示例CD31,CD68
CD31在WB中的注意事项：
由于CD31蛋白存在翻译后修饰，所以实际检测到的人类异构体蛋白条带大小在130kDa附近，与理论值79-83kDa有所区别。
CD31存在表达特异性，在不同组织/细胞中的表达水平存在明显差异，建议使用阳性对照。例如HUVEC、Jurkat全细胞裂解液。
CD68在WB中的注意事项：
由于CD68蛋白存在高度的糖基化修饰，所以实际检测到的条带大小在110-150kDa之间，与理论值32-37kDa有所区别。
CD68存在表达特异性，在不同组织或细胞中的靶标蛋白含量可能存在差异。若不确定检测样本中靶标蛋白的表达情况，建议使用阳性对照；同时，对于内源性CD68表达水平较低的细胞系和组织，建议优化实验条件，例如尝试增加上样量、降低抗体稀释倍数、延长曝光时间、使用超敏显色液等。
02
条带弥散：靶标示例CD63
CD63在WB中的注意事项：
由于CD63存在糖基化等的蛋白翻译后，导致实际检测蛋白分子量大小与预测不符，实际大小可能在30到60kDa左右。
CD63蛋白糖基化比较严重，因此WB检测到的条带可能都是弥散的条带。
不同组织和细胞里面由于CD63糖基化程度的不同，因此可能会导致CD63分子量在不同组织和细胞中有较大的差异。
CD63是一个多次跨膜蛋白，煮样可能导致蛋白聚集。如果检测不到预期实验结果，推荐提取蛋白时不煮样。
推荐使用抑制分泌试剂（例如Brefeldin A）处理细胞，抑制CD63分泌到细胞外，从而增强蛋白检测信号。
提取外泌体检测CD63蛋白时，蛋白丰度十分重要。若提取的外泌体中CD63含量较低，易出现无信号现象。
03
多带现象：靶标示例Integrin beta 1
Integrin beta-1在WB中的注意事项：
由于Integrin beta-1存在不同异构体和翻译后修饰，WB实验中检测到的条带大小（130-150 kDa）可能和预测值（~88 kDa）不一致，并可能出现多条条带现象，这很可能是基于翻译后修饰的糖基化条带。
当检测信号较弱时，可尝试优化实验条件，例如增加上样量、降低抗体稀释倍数、延长曝光时间、使用超敏显色液等。
如果想要去除糖基化修饰对靶标蛋白检测的影响，可尝试进行去糖基化实验，例如下图中检测PD1的WB实验中，加入PNGase F去除糖基化修饰后，可在WB结果中观察到预测分子量大小的靶标蛋白。
在WB实验中还遇到过哪些
翻译后修饰导致的条带异常问题
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